含Arg9的人抗HBsAg单链抗体／EGFP融合蛋白基因的构建、表达和内化作用的研究

目的:构建、表达和纯化带有转膜结构域Arg9的ScFv14／EGFP融合蛋白,并对纯化产物的亲和'活性和内化作用进行研究。方法:将Arg9的编码序列分别重组到ScFv14／EGFP基因的5'端、3'端和二者之间,将它们分别克隆入原核表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS进行诱导表达和纯化,用间接ELISA方法检测表达产物与HBsAg的亲和活性,并用间接免疫荧光检测纯化蛋白的内化活性。结果:经测序及酶切鉴定证实4种融合基因序列完全正确;SDS-PAGE和Western blot证实4种融合基因成功表达和纯化;间接ELISA检测证实4种融合蛋白均具有HBsAg结合活性,间接免疫荧光检测显示N端带有Arg9的融合蛋白有较强的内化作用,而且不内化进入HBsAg非表达的细胞。结论:成功构建、表达和纯化了ScFv14／EGFP融合蛋白和3种带有Arg9的ScFv14／EGFP融合蛋白,纯化产物均具有抗原HBsAg亲和活性,N端带有Arg9的融合蛋白与靶细胞作用有较强的内化作用。

吸烟和β3-肾上腺素能受体基因Trp64Arg、锰超氧化物歧化酶9Ala/Val基因多态性与非酒精性脂肪性肝病的相关性

目的探讨吸烟和β3-肾上腺素能受体（β3-AR））基因Trp64Arg、锰超氧化物歧化酶9Ala/Val（MnSOD9Ala/Val）基因多态性与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病之间的关系。方法采用病例-对照研究的方法,以720例NAFLD患者及720例健康对照者的外周血白细胞为样本,采用聚合酶链反应（PCR）技术分析β3-AR基因Trp64Arg和MnSOD9Ala/Val基因多态性。结果β3-AR基因Trp64Arg（A/A）基因型和MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型频率分布分别为39.4%、71.7%（病例组）和21.1%、43.3%（对照组）,差异有统计学意义（P〈0.01;P〈0.01）。Trp64Arg（A/A）基因型者患NAFLD的风险显著增加（OR=2.434,95%CI=1.816～4.075）。MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型者患NAFLD的风险也显著增加（OR=3.308,95%CI=1.913～4.509）。基因突变的协同分析发现,Trp64Arg（A/A）/MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型者在NAFLD组和对照组中的分布频率分别为32.8%和6.5%,差异有统计学意义（P〈0.01）。Trp64Arg（A/A）/MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型者患NAFLD的风险显著增加（OR=9.753,95%CI=4.292～12.426）。病例组的吸烟率显著高于对照组（OR=2.623,95%CI=1.425～4.957）,Trp64Arg（A/A）/MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型与吸烟有协同作用（OR=33.764,95%CI=18.907～61.582）。结论 Trp64Arg（A/A）/MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型和吸烟是NAFLD的易患因素,三者的联合在NAFLD的发生中起着协同的作用。

Arg9/人抗HBsAg单链抗体/EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性分析

目的:构建带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因,将其转化入大肠杆菌中进行表达,并分析表达产物与HBsAg的结合活性.方法:设计引物,将Arg9的编码序列引入单链抗体基因的5′端,PCR扩增后获得带有Arg9编码序列的ScFv14基因,将PCR产物连入pMD18-T载体,进行序列测定.将测序正确的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分别与EGFP基因连接后转化入原核表达载体pET32a,获得ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP两种融合基因的表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS,以IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析,并用间接ELISA方法检测其与HBsAg的亲和活性.结果:经酶切鉴定及测序证实ScFv14/EGFP融合基因和R9/ScFv14/EGFP融合基因序列完全正确.SDS-PAGE分析表明两种融合基因在大肠杆菌BL21中成功获得表达,表达量分别占菌体总蛋白的20%和25%.间接ELISA检测证实所表达的ScFv14/EGFP融合蛋白和R9/ScFv14/EGFP融合蛋白均具有HBsAg结合活性.结论:成功构建了带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因,并在大肠杆菌BL21中成功表达,表达产物ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP均具有与抗原HBsAg特异性结合的活性.

牛c-Myc/TAT/9R融合表达载体构建及其原核表达研究

原癌基因c-Myc虽然在许多肿瘤组织中特异性高表达,但它也是机体正常细胞生长与增殖所必需的因子,然而目前家畜诱导多潜能干细胞(iPS)研究中关于多功能转录因子cMyc的报道很少。为此,研究拟利用蛋白转导区域(PTD)的跨膜作用,构建TAT-bc-Myc-9R融合表达载体,并对其进行原核表达,旨在为转录因子蛋白重编程牛体细胞奠定基础。试验以牛c-Myc基因编码区序列为参考,设计并合成含酶切位点、跨膜转导肽TAT和9R的引物,利用PCR等基因工程方法获得包括牛c-Myc、TAT和9R的重组原核表达载体(pTAT-HA-bcMyc-9R);酶切鉴定和DNA测序结果表明,试验成功获得bc-Myc-9R重组序列,成功构建重组质粒pTAT-bc-Myc-9R;不同IPTG浓度和诱导时间条件对该重组载体的诱导表达和SDSPAGE分析表明,TAT-bc-Myc-9R在0.6mmol/L IPTG和37℃诱导6h条件下表达约57KDa的目的蛋白。这些结果为PTD介导的转录因子蛋白直接重编程牛体细胞以获得iPS研究积累了科学资料。

瘦素受体基因Gln223Arg、锰超氧化物歧化酶9Ala/Val基因多态性与吸烟的交互作用和非酒精性脂肪性肝病关系

目的探讨瘦素受体（LEPR）基因Gln223Arg、锰超氧化物歧化酶9Ala/Val（manganese superoxide dismutase9Ala/Val,MnSOD9Ala/Val）基因多态性与吸烟的交互作用与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的关系。方法采用病例-对照研究的方法,以600例NAFLD患者及600例健康对照者的外周血白细胞为样本,利用PCR分析LR基因Gln223Arg和MnSOD9Ala/Val基因多态性。结果 LR基因LEPR Gln223Arg（G/G）基因型和MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型频率分布分别为48.67%、50.17%（病例组）和21.17%、21.50%（对照组）,二者经χ2检验差异有显著性（P〈0.01;P〈0.01）。Gln223Arg（G/G）患NAFLD的风险显著增加（OR=3.5309,95%CI 1.8165~5.0724）。MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型者患NAFLD的风险也显著增加（OR=3.6756,95%CI=1.9137~5.5496）。基因突变的协同分析发现Gln223Arg（G/G）/MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型者在NAFLD组和对照组中的分布频率分别为40.33%%和7.50%,二者经χ2检验有显著性差异（P〈0.01）。Gln223Arg（G/G）/MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型者患NAFLD的风险显著增加（OR=8.4014,95%CI 4.2926~12.4238）。病例组的吸烟率显著高于对照组的吸烟率（OR=3.6754,95%CI 1.4193~4.9581,P〈0.01）,吸烟与Gln223Arg（G/G）和MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型均有交互作用（OR=8.5476;OR=8.8665）。结论Gln223Arg（G/G）/MnSOD9Ala/Val（V/V）基因型和吸烟是NAFLD的易患因素,基因多态性与吸烟的交互作用增加了NAFLD的发病风险。

髓源抑制性细胞在卵巢癌患者外周血中的检测及临床意义

目的检测卵巢癌患者外周血中髓样抑制性细胞(MDSCs)及相关临床意义。方法选择2017年6月至2019年6月于本院收治并确诊为卵巢癌患者40例和健康志愿者30例为观察对象。分别收集卵巢癌患者和健康体检者的外周血各5ml,通过流式细胞术检测MDSCs在外周血中的表达;应用RT-PCR技术检测卵巢癌外周血单个核细胞中精氨酸酶1(ARG1)、环氧化酶-2(COX-2)、S100A8和S100A9基因的表达;应用ELISA方法检测血清中ARG1和S100A9蛋白的表达。结果外周血中的MDSCs(CD11b+CD33+HLADRlow/-)在卵巢癌患者中的表达水平明显高于正常组(P<0.001)。另外在卵巢癌患者单个核细胞中ARG1、COX-2、S100A8和S100A9的mRNA表达量也明显高于正常组(P<0.05)。ARG1和S100A9蛋白在卵巢癌患者血清中的表达水平高于正常组(P<0.001)。结论卵巢癌患者外周血中MDSCs细胞比例及相关因子表达增高可以作为卵巢癌发病和预后的参考依据。