慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)聚羟丁酸合成酶基因(phbC)突变体的构建及其特性

通过转座子Tn5诱变和同源重组 ,构建了BradyrhizobiumjaponicumUSDA110聚羟丁酸合成酶基因 (phbC)突变体 .序列测定确定了转座子插入的精确位置 ,所获得的 4个转座子诱变的质粒其Tn5插在 phbC基因内两个相距仅 9bp的位点 .被Southern和PCR证实的突变体菌株仍能产生相当于野生型菌株 12 .97%～ 2 5 .10 %的PHB ,并且在突变体和野生型菌株总DNA杂交图上都呈现出一条约 5kb的阳性带 ,推测在B .japonicum基因组中存在不止一个聚羟丁酸合成酶基因 .图 3表 4参

影响亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性的因素分析

目的了解影响女性亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T、A1298C位点和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)A66G位点基因多态性的因素。方法采用横断面调查研究方法,以湖北省内1 902例女性为对象,采集口腔黏膜上皮细胞,提取DNA,用实时荧光定量PCR技术检测MTHFR和MTRR基因,统计分析不同民族MTHFR和MTRR基因多态性的差异,与其他地区人群的MTHFR和MTRR基因多态性进行比较,并分析不同位点基因多态性之间的关联关系。结果 (1)湖北省汉族女性和少数民族女性在MTHFR C677T和MTRR基因多态性构成差异无统计学意义(P>0.05),而MTHFR A1298C位点基因多态性构成差异有统计学意义(P<0.05)。(2)MTHFR C677T位点的纯合突变基因型TT的频率从南到北呈上升趋势,MTHFR A1298C位点的纯合突变基因型CC的频率从南到北呈下降趋势,而MTRR A66G位点基因多态性在不同地区差异不大。(3)MTHFR C677T位点的纯合突变基因型TT的频率在A1298C位点的正常型、杂合型、纯合突变型中分别为15.9%、0.1%、0.0%,差异有统计学意义(P<0.01);MTHFR C677T位点的纯合突变基因型TT的频率在MTRR A66G位点的正常型、杂合型、纯合突变型中分别为9.4%、5.9%、0.7%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MTHFR A1298C位点基因多态分布存在民族差异;而MTRR C677T、A1298C位点基因多态分布存在地区差异;同一基因不同位点的基因多态性有关联。

北京红篓菌聚羟基烷酸合成酶基因的克隆与表达

以北京红篓菌基因组DNA为供体 ,pKC5 0 5cosmid质粒为载体系统 ,λ 噬菌体体外包装重组质粒并转染感受态细胞E .coliJM1 0 9,构建了该菌株基因组DNA文库。以聚羟基烷酸 (PHA)合成酶基因通用简并引物扩增的PHA合成酶部分基因为探针 ,经DIG标记后利用菌落原位杂交技术对文库进行筛选 ,获得 3个阳性克隆菌株 ,PCR检测证明这 3个克隆具有PHA合成酶基因片段 ,酶活测定表明

中国人群醛固酮合成酶基因T-344C位点单核苷酸多态性频率分析

目的研究醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344C单核苷酸多态性(SNP)在中国人群中的分布。方法采用PCR-RFLP法对中国人群进行醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344CSNP频率分析比较。结果中国人群的醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344C基因型频率分布:TT型占64.5%,TC型占30.8%,CC型占4.7%;等位基因频率T占79.9%,C占20.1%。各基因型频率、等位基因频率与西班牙人、德国人、苏格兰人、日本人差异非常显著。结论醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344CSNP频率的分布有明显的种族差异。

一氧化氮合成酶（NOS）基因表达的半定量检测及其应用

参照Ｍａｒｔｉｎ（１９９３）定量ＲＴ－ＰＣＲ方法，建立一种灵敏、简捷、特异的半定量ＮＯＳｍＲＮＡ测定方法；证明了ＮＯＳｍＲＮＡ不仅存在于脑组织，亦广泛分布于心、肾、肺和肝组织中，其中以脑组织含量最高，肾、心次之，除内皮细胞以外平滑肌细胞中亦有ＮＯＳ基因的表达；此外，本工作还观察到自发性高血压大鼠的脑、肾、肝和平滑肌细胞中ＮＯＳｍＲＮＡ水平下降，表示ＮＯＳ基因表达受抑，可能与高血压的病因密切相关。

慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)聚羟丁酸合成酶基因(phbC)的克隆和序列测定

以苜蓿根瘤菌Rm10 2 1的 phaC基因突变体菌株Rm1114 4 (phaC ::Tn5 - 2 33)为受体菌 ,通过功能互补 ,成功地从构建的Bradyrhizobium japonicum USDA110基因文库中 ,筛查到能与Rm1114 4互补 ,使之恢复在以乙酰乙酸为唯一碳源的M9培养基 (M9-AA)平板上 5d形成明显可见菌落 ,以及在MOPS平板上形成粘液型菌落的表型的重组粘粒 pDC2 ;经证实 ,该粘粒带有 phbC基因 .完成了该基因的全序列测定并已在GenBank登记 ,登记号为AY0 775 80 .B .japonicumphbC基因由 180 3碱基对组成 ,GC含量 6 1.8% ,AT含量 38.2 % ;编码 6 0 0个氨基酸 ,Mr=6 6 .95× 10 3 .图 3表 3参

γ-PGA合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

研究了γ-PGA合成酶基因pgsBCA在大肠杆菌中的克隆和表达,以pET28a(+)为载体,构建表达载体pET28a(+)-pgsBCA,导入宿主Escherichia coli Rosetta中,诱导使之表达。将发酵液离心去除菌体,得到上清液用旋转蒸发仪浓缩后,采用SDS-PAGE电泳检测重组菌E.coli Rosetta/pET28a-pgsBCA产生的γ-PGA分子量在200-300kDa之间,将产物水解,采用薄层层析法鉴定产物由单一的谷氨酸组成,表明γ-PGA合成酶基因pgsBCA在大肠杆菌中成功表达。

白色链霉菌ε-聚赖氨酸合酶的异源表达及重组菌全细胞合成ε-聚赖氨酸的条件优化

聚赖氨酸是一种典型的同型L-赖氨酸聚合物,具有广谱抗菌活性和抗噬菌体活性,广泛应用于食品和医药行业。该文克隆了经密码子优化的白色链霉菌Streptomyces albulus来源的ε-聚赖氨酸合酶编码基因pls,首次实现了其在食品安全性菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中的异源表达。其次,对B.subtilis 168/p MA5-pls重组菌株生产ε-聚赖氨酸的全细胞催化体系进行了优化,结果表明,在L-赖氨酸质量浓度0.5 g/L,初始pH和温度分别为3.0和30℃条件下,ε-聚赖氨酸合酶的转化效果最好。在最优体系条件下,连续转化4 h,ε-聚赖氨酸的产量达到195.1 mg/L,高于已报道的Bacillus subtilis直接发酵生产的ε-聚赖氨酸产量。该研究构建的全细胞催化体系为食品级ε-聚赖氨酸的生产提供了新策略。

纳米二氧化硅对HaCaT细胞中PAPR-1基因表达及其启动子甲基化的影响

目的研究纳米二氧化硅（nm—SiO2）对人皮肤表皮细胞系（HaCaT）细胞中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（poly[ADP-ribose]polymerase 1，PARP-1）基因的表达及其基因启动子区甲基化的影响。方法分别以2．5、5．0、10．0μg／ml的nm-SiO2溶液和10μg／ml的微米级SiO2（micro-SiO2）溶液处理HaCaT细胞24h；以3μmol／LDNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza—CdR，DAC）处理48h10μg／ml的HaCaT细胞为阳性对照（DAC组），并设立溶剂对照组（CTRL组）。应用荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和蛋白质印迹法（Western-blot法）检测PARP-1在mRNA水平和蛋白水平的表达变化，应用亚硫酸氢盐测序（bisulfite pyrosequence，BSP）法检测PARP-1基因启动子区CpG岛的甲基化状态。结果HaCaT细胞暴露nm-SiO224h后，经nm-SiO2处理后，micro-SiO2染毒组和2．5μg／ml染毒组PARP-1表达与CTRL组的差异无统计学意义（P〉0．05），与CTRL组比较，5、10μg／ml染毒组及DAC处理组细胞的PARP-1表达下调，差异有统计学意义（P〈0．05），且其下调水平随着浓度的增大而增高。BSP结果显示PARP-1启动子区-229点甲基化状态升高。结论nm-SiO2可以降低HaCaT细胞中PARP-1基因的表达，可能与其对PARP-1基因启动子区CpG岛的甲基化影响有关。

重组大肠杆菌转化甘油合成聚3-羟基丙酸-co-乳酸

聚羟基脂肪酸酯作为性质优良的生物塑料,引起了广泛的关注。由于聚羟基脂肪酸合成酶PhaC特异性较强,难以通过生物合成方法获得含乳酸单体聚合物。为了实现乳酸的聚合,PhaC的筛选至关重要。以甘油为底物,通过引入Klebsiella pneumoniae的甘油脱水酶DhaB123及其激活因子GdrAB以及Salmonella typhimurium LT2的丙醛脱氢酶基因PduP,获得3-羟基丙酰辅酶A;通过引入Megasphaera elsdenii DSM 20460的丙酰辅酶A转移酶PCT,获得乳酰辅酶A;并对3种不同聚羟基脂肪酸合成酶的作用进行考察。在Pseudomonas putida的原始酶PhaC1或者PhaC2的作用下,不能实现乳酸的聚合;而在双位点突变（Ser325Thr和Gln481Lys）的PhaC1（STQK）存在条件下,重组菌可以利用甘油合成聚3-羟基丙酸-co-乳酸。经过对溶氧、有机氮源等发酵条件的优化,聚3-羟基丙酸-co-乳酸的产量可以达到0.22g/L,占细胞干重的3.2%,是含乳酸单体聚合物生物合成研究的一次有益尝试。

抑制聚ADP-核糖聚合酶-1活性降低HEK293/tau441细胞tau蛋白的磷酸化

为了研究聚ADP-核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]对微管相关蛋白tau磷酸化水平的影响,本实验分别用不同剂量(0.5,1,2,4mmol/L)的PARP-1的抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)处理稳定表达tau441蛋白的HEK293细胞。24h后观察细胞的形态学变化,并用免疫印迹的方法检测PARP-1的聚ADP-核糖化修饰变化、微管相关蛋白tau的磷酸化水平和糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase3,GSK-3)的活性改变情况。结果显示:(1)不同浓度的3-AB处理HEK293/tau441细胞后,细胞形态未发生显著的变化;(2)PARP-1的活性下降引起tau蛋白Ser195/198/199/202位点的非磷酸化增强;(3)PARP-1的活性抑制使tau蛋白Thr231位点的磷酸化下降,同时细胞内的GSK-3的活性也下降。结果提示,PARP-1的活性抑制可能通过下调GSK-3的活性,降低tau蛋白磷酸化水平。

重组肺炎克雷伯氏菌转化甘油为聚3-羟基丙酸

聚3-羟基丙酸[Poly(3-hydroxypropionate),P3HP]是一种生物可降解及生物相容的新型聚羟基脂肪酸酯。目前已鉴定的生物均不能天然合成P3HP。采用PCR克隆鼠伤寒沙门氏菌的丙醛脱氢酶(Pdu P)基因及罗尔斯通氏菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶(Pha C)基因,构建共表达载体,转化肺炎克雷伯氏菌后获得两株重组菌。以甘油为唯一碳源进行摇瓶发酵,pdu P和pha C共用tac启动子的工程菌K.p(p ET-tac-pdu P-pha C)产生0.054 g/L的P3HP,而pdu P和pha C各自独用tac启动子的工程菌K.p(p ET-tac-pdu P-tac-pha C)产生0.091 g/L的P3HP。

基于二氧四氢喋啶合酶多聚纳米抗体的血清中可溶性PD-L1蛋白检测方法

目的:基于二氧四氢喋啶合酶(LS)多聚纳米抗体,建立一种检测血清中可溶性细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)蛋白的方法。方法:采用竞争ELISA筛选识别PD-L1不同表位的纳米抗体作为配对抗体,建立双纳米抗体夹心ELISA检测方法(Nbs-ELISA)。为了进一步提高敏感性,将纳米抗体与LS进行融合,获得多聚形式的纳米抗体作为sPD-L1蛋白的捕获分子,建立基于LS的多聚纳米抗体ELISA检测方法(LSNbs-ELISA)。结果:与Nbs-ELISA方法相比,LSNbs-ELISA方法对sPD-L1的检测敏感性提高了约11倍,Nbs-ELISA对血清中sPD-L1的检出限为2.87 ng/ml,而LSNbs-ELISA对PD-L1的检出限为0.255 ng/ml。2种检测方法对sPD-L1的检测均具有很高的特异性,与掺入血液中的PD-1、CD27、CD70、CD137和CD147蛋白均不结合。结论:建立的基于LS多聚纳米抗体检测血清中PD-L1的检测方法有较高的敏感性和特异性,对肺癌患者血清中可溶性PD-L1的检测具有潜在的临床应用价值。