杂交探针技术结合熔解曲线快速鉴别水痘-带状疱疹病毒野毒株/疫苗株

目的利用杂交探针结合熔解曲线分析技术，建立一种快速、可靠的适用于鉴别水痘一带状疱疹病毒（Varicella—zosterVirus，VZV）野毒株与疫苗株的方法。方法采集临床诊断为水痘患者的水疱液并进行病毒分离，抽提阳性分离物和部分阳性水疱液的基因组脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid，DNA）。以荧光素Cy5．5标记检测探针5端，相应的锚定探针在3端用FAM羧基荧光索标记，再从研究对象基因组DNA中用聚合酶链反应（PolymeraseChainReac—tion，PCR）特异引物扩增ORF62基因中301碱基对（basepair，bp）片段，将其与特异探针杂交后，引发荧光共振能量转移，通过罗氏LightCycler实时PCR仪描绘扩增的目标DNA片段的熔解曲线，根据熔解温度（MeltingTemperature，Tm）峰值对待测标本进行鉴别。最后，用限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）方法验证杂交探针结合熔解曲线鉴别野毒株／疫苗株的准确性。结果VZVOka疫苗株的扩增产物与检测探针的Tm为52．47℃，而水痘原始临床标本／临床分离株与检测探针的Tm在57．33℃～60．50℃。通过检测DNA扩增产物与VzVORF62探针Tm的差异可以明确鉴别VZV野毒株和疫苗株。利用杂交探针技术结合熔解曲线的方法对水痘原始临床标本及分离株进行野毒株／疫苗株的鉴别结果与传统的RFLP方法进行鉴别的结果完全一致。结论杂交探针技术结合熔解曲线操作简便省时，不易交叉污染；获得的病毒野毒株／疫苗株特征性强，适用于VZV野毒株／疫苗株在临床和流行病学调查中的快速鉴别诊断。