刺激植物响应蛋白基因Epl1克隆、原核表达及功能初探

【目的】研究刺激植物响应蛋白Epl1对木本植物山新杨的刺激响应功能,为开发新一代提高植物免疫的新型诱导剂奠定基础。【方法】从棘孢木霉ACCC30153菌株中克隆获得一个刺激植物响应蛋白基因Epl1,并进行序列分析和原核表达,将获得的原核重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗进行互作,初步探讨rEpl1蛋白对山新杨生长、生理指标、以及生长和防御相关基因转录水平的影响。【结果】刺激植物响应蛋白基因Epl1的cDNA序列全长为417bp,预测蛋白分子量12.6 kDa,属于Cerato-platanin家族;通过构建原核表达载体,成功获得重组蛋白rEpl1;在1μg/mL rEpl1诱导下,山新杨组培苗生长较快、根系旺盛,生物量明显增加,CAT活性在诱导第1 d时为对照的3.51倍,可溶性糖含量和脯氨酸含量在诱导初期急剧积累;山新杨生长素基因LAX2/AUX和水杨酸防御基因JAR2的转录水平分别在蛋白诱导2 d和12 h时达到峰值,分别为对照的873.10和388.02倍。【结论】Epl1基因的克隆、序列分析和原核表达为进一步研究Epl1蛋白诱导植物系统抗病性提供了理论基础;重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗互作实验,初步Epl1蛋白能够刺激木本植物在生理及分子水平上的响应,从而促进生长,提高抗性。

木霉诱导下山新杨PodaPIN9基因的组织表达调控

PIN蛋白具有多个跨膜结构域,影响着高等植物生长素的外向运输和众多生长发育过程。木霉菌是能促进植物生长、提高其对多种病害防御作用的生防因子。研究木霉菌对木本植物山新杨生长素的极性分布的影响有重要意义。克隆了山新杨PodaPIN9基因,对其核酸和蛋白序列进行分析;同时,构建的进化树显示PodaPIN9与6个物种的9条PIN基因具有高度一致性(> 80%)。qRT-PCR分析表明,PodaPIN9在山新杨茎尖、成熟叶和根中均有表达。在根中表达量极低;在茎尖和叶中的表达量极高,分别是根中的503和346倍。该基因受木霉影响在茎尖和叶中的表达量均显著下调;而根中的表达量显著上调,达到对照的32. 01倍。并发现根际接种木霉48h会使杨树茎尖、叶和根中生长素含量降低。说明木霉菌能影响杨树茎尖、叶和根中IAA水平及PodaPIN9的表达量。并且Pearson相关性分析表明在茎尖、叶和根中,PodaPIN9表达量与IAA水平具有不同的相关性。

一株能拮抗3种土传病害病原真菌的长枝木霉

为了丰富生防木霉菌(Trichodermaspp.)种资源,在园林植物八宝景天(Sedum spectabile)根际土壤中分离得到一株优势木霉。根据该菌株菌落的形态特征、形态学显微观察、菌株rDNA-ITS序列分析以及邻接法同源性比对等结果判定木霉菌株种类。采用平板对峙法将该菌株与3种土传病害病原菌[(Sclerotinia sclerotiorum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和细链格孢菌(Alternaria alternata)]进行对峙培养。并用该木霉诱导山新杨(Populus davidiana×P.albavar.Pyramidalis)组培苗,观察离体叶片抵抗细链格孢菌侵染的能力。结果表明,此木霉为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum),命名为Tl-70。该菌株对3种土传病害病原真菌均有较明显的拮抗作用。对核盘菌的抑菌率最高为77.71%,显著高于对细链格孢菌和立枯丝核菌的抑制率(P<0.05);对立枯丝核菌的抑菌率为58.56%,显著高于对细链格孢菌的抑制率(P<0.05);对细链格孢菌的抑菌率最低,为53.32%。并且,该木霉能提高山新杨组培苗叶片拮抗细链格孢菌侵染的能力。说明此菌株是具有潜力的生防菌株。

绿洲农田防护林系统土壤蒸发特征研究

以景电灌区绿洲农田防护林系统为研究对象,通过对农田防护林系统内土壤水分蒸发的测定分析,结果表明:在1H范围内,越靠近林带,土壤蒸发量越大。随着与林带距离的增加,土壤蒸发量有先减小后增大的趋势;农田防护林系统内土壤水分蒸发量在灌溉前后有先增加后减小的趋势,并且对照点土壤水分蒸发量始终高于林网内观测点,林网内土壤蒸发量与对照点相比平均减少了35.17%。说明绿洲农田防护林系统能有效减弱土壤蒸发量;相关分析表明,系统内土壤水分蒸发量受到土壤本身和气象因子的制约,其影响程度大小依次为土壤含水量>太阳辐射>空气相对湿度>风速>气温,其中土壤含水量、太阳辐射、气温、风速与土壤蒸发量成正相关,空气相对湿度与其成负相关关系。

河北杨和新疆杨离体叶片诱导不定芽研究

对河北杨和新疆杨离体叶片诱导不定芽的方法进行了研究。结果表明，适合河北杨和新疆杨离体叶片不定芽诱导的最适培养基为：1／2MS＋0．25mg／L 6-BA＋0．01mg／LTDZ＋0．25mg／L IAA;在此培养基中，叶片分化率河北杨可达70％，新疆杨可达52％；平均分化芽数河北杨为6．84个，新疆杨为5．32个。6-BA单独使用对叶片不定芽诱导没有效果，NAA作用不明显。叶片刻伤方式对两种杨树叶片诱导不定芽影响显著，沿中脉横切效果优于去除叶边缘，诱导的不定芽数前者比后者约多3个。光照显著影响叶片不定芽产生的时间，不定芽在3～5d暗培养后转至16h／d光照下培养比全程16h／d光培养发生早15d左右；光照对分化率和平均分化芽数无显著影响。

一种快速有效的741杨离体叶片再生芽方法(英文)

在对杂交品种 741杨 (Populusalba (P .davidiana×P .simonii)×P .tomentosa)进行农杆菌介导法转基因的试验中发现了一种快速有效的叶片再生芽的方法。首先叶片外植体在培养基I(MS培养基添加 0 .5mg/LBA和 1 .0mg/L 2 ,4 D)上培养 2～ 3d ,再转移到培养基SH(MSmediumcontaining 2 .0mg/LofBAand 0 .1mg/LofNAA)上培养 1 0d ,然后再转移到培养基II(MSmediumwith 0 .5mg/LofBA)上 ,培养大约 5d之后 86.7%的叶片外植体产生的芽 ,每片叶片外植体 ( 1cm× 1cm)可产生 40～ 5 0个芽。但是 ,如果叶片外植体在培养基I上培养的时间长于 5d ,再依次转移到培养基SH和II上 。

银新杨组织培养快繁技术的研究

以银新杨萌发芽为外置体进行组培快繁技术研究，结果表明，初代培养阶段适宜的培养基为附加6-BA0．1mg·L^-1的改良MS培养基；继代与增殖培养阶段适宜的培养基为附加6-BA0．1mg·L^-1以＋IAA0．5mg·L^-1的培养基，增殖倍率为12～18倍；生根培养阶段，以1／2MS＋NAA0．01mg·L^-1组合效果最好，15d根系基本形成。

棘孢木霉葡聚糖酶基因Glu1的克隆及原核表达

从棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536中克隆获得一个葡聚糖酶基因Glu1,其cDNA全长984bp,编码327个氨基酸。该葡聚糖酶属于Glyco-hydro-12家族,推测为β-1,4-葡聚糖酶,与深绿木霉IMI 206040的Glycohydro-12家族蛋白(XP_013940397.1)有91%相似性,且亲缘关系较近。运用qRT-PCR技术检测9种诱导条件下棘孢木霉Glu1基因的表达水平,结果表明,Glu1基因能参与棘孢木霉对山新杨(Populus davidiana×P.alba var.pyramidlis)或杨树病原菌的识别。构建原核表达载体并获得重组蛋白rGlu1。酶活特性分析结果表明,该酶最适pH为4.5,最适温度为45℃,且酶活性随诱导时间延长逐渐升高,在5h达到稳定。

3个棘孢木霉菌株对山新杨组培移栽苗生长和光合特性的影响

为了收集具有促进林木生长作用的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)功能菌株,本研究采用盆栽方法,以1年龄山新杨(Populus davidiana×P.albavar.pyramidalis)组培移栽苗为试材,分析了根施5×10~3 cfu·cm^(-3)土的3个棘孢木霉菌株Ta492、Ta536和Ta4分生孢子对山新杨幼苗生长状况、叶绿素含量、光合日变化及光响应曲线特征参数的影响。结果发现,经3个棘孢木霉菌株诱导后,杨树苗苗高、地径及生物量均不同程度地高于对照组(CK);杨树苗叶绿素含量和叶绿素a/b在多数时间点均显著高于CK(P<0.05),为光合速率的提高奠定了物质基础。同时,试验组杨树苗叶片的净光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)、蒸腾速率(T_r)的日变化均高于CK,但变化趋势均与CK相同;并且,最大净光合速率(P_(n max))、光饱和点(LSP)、表观量子效率(AQY)等光响应曲线特征参数也在不同程度上高于CK。说明这3个棘孢木霉菌株均能有效提高山新杨的光合能力,促进其生长。并且,Ta536菌株对山新杨幼苗的诱导效果最好。

转基因741杨原生质体游离与纯化研究

以转双抗虫基因741杨无菌苗叶片为材料,对叶片原生质体游离、纯化方法及影响因素等进行了分析研究。结果表明,上部叶片产量和活力均高于其他叶位,在实验的浓度范围之内,Macerozyme R-10(离析酶)、Cellulase Onozuka R-10(纤维素酶)、Driselase(Sigma)(崩溃酶)对原生质体的产量和活力无显著影响。适宜转双抗虫基因741杨叶片原生质体游离与纯化的条件为无菌苗上部叶片为材料,0.7mol/L甘露醇的CPW盐溶液预质壁分离1～1.5hCPW+0.5%Macerozyme R-10+0.25%CellulaseOnozuka R-10+0.025%Driselase(Sigma)+0.5mol/L甘露醇(pH 5.7),酶解温度27℃,酶解时间10h,用"过滤-离心-漂浮法"纯化原生质体。

棘孢木霉组合应用对杨树生长和光合特性影响

为研制复方棘孢木霉菌肥制剂,在大田条件下将等浓度(5×10~3cfu·cm^(-3)土)不同组合的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)分生孢子T1(Ta536+Ta4)、T2(Ta536+Ta4+Ta492)和T3(Ta536+Ta4+Ta492+Ta650)根施山新杨(Populus davidiana×P.alba var.Pyramidalis)组培移栽苗,研究棘孢木霉组合施用对山新杨生长及光合特性的影响。方差分析结果表明,诱导时间和不同处理对苗高、地径、叶绿素含量、叶绿素a/b值、P_n、Cond、C_i和T_r均有显著影响(P<0.05):处理组的山新杨苗高、地径及干物质量均在不同程度上高于对照组(CK),作用效果为T3>T2>T1>CK;60 d时,T3、T2和T1组杨树苗生物量分别比CK增加17.99%、14.28%和10.54%;15 d时叶绿素含量比CK分别提高7.79%,6.91%和4.17%;叶绿素a/b值分别比CK提高7.79%、5.84%和4.73%。此外,处理组净光合速率(P_n)、胞间CO_2浓度(C_i)、气孔导度(Cond)、蒸腾速率(T_r)均高于CK,并且处理组的最大净光合速率、表观量子效率以及光饱和点均高于CK。同时,诱导时间和不同处理的交互作用对检测的多数指标(除P_n和C_i外)均具有显著影响(P<0.05)。说明4个棘孢木霉菌株组合施用具有协同作用,能提高菌株对环境条件的适应性,增强促生长和改善光合的作用效果。并且T3组对山新杨苗的影响最大、作用速度最快。

用水量平衡法确定风沙草原区造林密度

通过对嫩江流域风沙草原区中小黑杨、樟子松、落叶松、银中杨等4个造林树种蒸腾速率观测,并结合各区域降水量,采用水量平衡法初步确定了这4个树种的合理造林密度。