Optimization of IBRS-2 Cells Culturing Conditions for Cultivation of Porcine Parvovirus N Strain Using Roller Bottle

The aim was to optimize the roller bottle culture system of IBRS-2 cells for cultivation of porcine parvovirus （PPV） N strain using a four-factor three-level or- thogonal test （cell culture medium pH value： 7.0, 7.2 and 7.4; inoculation time： 0, 24 and 48 h; inoculation dose： 0.10%, 1.00% and 10.00%; harvest time： 48, 72 and 96 h）. The results showed that the optimal conditions were as follows： cell culture medium pH value of 7.2, synchronous inoculation, inoculation dose of 0.10% and culture time of 96 h. Among the four factors, culture time was the most important factor affectina the virulence titer of PPV N strain.

猪细小病毒弱毒株（PPV_（s－1）A）及其疫苗的免疫效力

以ＰＰＶｓ－１Ａ株弱毒肌肉接种后备母猪２头，每头注射１ｍＬ。接种后第８天的ＨＩ价为１２８～２５６。以后抗体上升，攻毒前ＨＩ价平均为１２８０。对照母猪２头ＨＩ抗体均为阴性。４头母猪配种后，怀孕至３８～４０ｄ时攻毒，结果从接种母猪的血浆中没有分离到病毒，而对照母猪的血浆中则分离到病毒。攻毒４０ｄ后宰杀，接种母猪共怀２５头胎猪，从它们的脏器中均没有分离到病毒，而对照母猪共怀２３头胎猪，其中有１０头的脏器分离到病毒。４批弱毒苗免疫１１头５．５月龄阴性猪，１周内全部产生抗体反应，１个月时平均ＨＩ价为５９９，免疫后１～７个月攻毒，结果免疫猪的血浆和内脏均未分离到病毒，相反，８头对照猪在攻毒前ＨＩ价保持阴性，攻毒后１周ＨＩ１０２４～４０９６，从血浆和内脏都分离到病毒。试验证明，弱毒苗免疫持续期至少为７个月；保存期１１个月。

联合表达PCV2 ORF2和PPV VP2基因病毒样颗粒获得及免疫原性

将包含有完整闼读框架，长1740、705bp的PPVVP2基因、PCV2ORF2基因分别插入真核表达载体pPI-2．EGFP，构建了重组质粒pPi-Z．EGFP．VP2．ORF2。观察由脂质体介导转染重组质粒后的Vero细胞，结果最早在转染后20h左右出现荧光，36h达到高峰；对转染细胞进行电镜检测，结果观察到病毒样颗粒存在。为证实所获病毒样颗粒是否为重组颗粒，将纯化后的病毒样颗粒免疫仔猪，检测其血中T淋巴细胞的动态变化以及血清抗体水平。结果免疫仔猪的CD3＋、CD4＋T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均有一定程度的升高；CD8＋T淋巴细胞在免疫后7～14d有所下降，之后再升高。抗体检测结果表明，免疫动物血清中有较高水平的PPV、PCV2特异性抗体。结果表明重组质粒pPI-2．EGFP．VP2．ORF2获得成功表达并形成重组病毒样颗粒，且该颗粒具有良好的免疫原性。

检测PCV_2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、细小病毒(PPV)、及伪狂犬病毒(PRV)疫苗株与野毒株 的多重PCR方法。根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特 异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp(PCV2)、 581bp(PPV)、372bP(PRV gB)及147bp(PRV gE)四条特异性片段。对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR 扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为 106.2、103.8、10-5.8 TCID50的模板。该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要 意义。

猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因共表达对PPV病毒样颗粒形成的影响

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,得到了重组质粒pPI-2.EG-FP.VP2。再以含有PCV2 SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因,进一步将其插入pPI-2.EGFP.VP2中,构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的真核表达载体pPI-2.EG-FP.VP2.ORF2。用脂质体介导法将pPI-2.EGFP.VP2.ORF2 DNA转染Vero细胞,观察绿色荧光蛋白的融合表达,采用ELISA方法检测转染液与PPV、PCV2高免血清的反应特性,同时将转染出现绿色荧光明显的Vero细胞制备电镜样品。结果显示,VP2基因、ORF2基因与绿色荧光蛋白得到融合表达,转染液与PPV、PCV2高免血清具有良好的抗原抗体反应特性,电镜观察到重组病毒样颗粒的形成。

不同代次的猪细小病毒(PPV S-1株)NS1基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪细小病毒PPV NADL-2株NS1基因序列设计了一对引物,以PPV S-1分离株不同传代代次的DNA为模板,进行PCR扩增,将扩增产物分别克隆到pGEM-T载体中进行测序。结果表明:扩增片段长约2.2 kb,包含完整的NS1基因,共编码662个氨基酸。应用DNAStar软件进行序列分析,结果显示:所有代次的NS1核苷酸同源性在99.4%以上,氨基酸同源性在98.5%以上;PPV S-1分离株在传代致弱的过程中,NS1基因出现了一些变异,有4处较为一致的突变,即1 052位C→T、1 636位G→A、1 717位A→G、1732位T→G,对应的氨基酸变化分别为Thr^(351)→Met^(351)、Val^(546)→Met^(546)、Asn^(573)→Asp^(573)、Ser^(578)→Ala^(578),这可能是PPV S-1在ST细胞上传代致弱的分子基础之一。

PPV_(S-1)A株保存期研究及免疫原性测定

为了确保疫苗质量,保证生产用种毒的稳定性,将猪细小病毒PPVS-1A株的干毒和湿毒分别在-20℃和-70℃保存,每12个月取样一次,分别进行病毒含量测定、红细胞凝集价测定、乳鼠安全试验和豚鼠抗体检测。结果病毒含量均大于107.25;红细胞凝集价为1∶1024;乳鼠接种未见不良反应;豚鼠抗体检测HI均不低于1∶32。确定猪细小病毒PPVS-1A株湿毒在-20℃的保存期为24个月,在-70℃的保存期为48个月;猪细小病毒PPVS-1A株冻干毒在-20℃的保存期为36个月,在-70℃的保存期为60个月。猪细小病毒PPVS-1A株毒保存期长,具有良好的安全性和免疫效力。

PPV-VP2蛋白和PCV2-Cap蛋白二联亚单位疫苗的研究

【目的】研制PCV2ORF2基因编码的Cap蛋白与PPV VP2结构蛋白二联亚单位疫苗。【方法】设计截去NLS信号肽序列的Cap蛋白氨基酸序列和VP2蛋白氨基酸全序列,分别进行大肠杆菌偏嗜密码子优化,构建重组表达质粒,利用大肠杆菌表达系统表达出可溶性的Cap蛋白和VP2重组蛋白。将重组蛋白纯化后分别与ISA201佐剂混合制备单苗和二联亚单位疫苗,免疫ICR小鼠,同时设立PBS空白对照和大肠杆菌BL21对照。首免后21d进行加强免疫,利用MTT比色法、细胞中和试验法和ELISA法对免疫小鼠淋巴细胞的转化功能及细胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α)mRNA水平、免疫后中和抗体效价以及ELISA抗体水平进行检测。小鼠二免21d后进行PPV和PCV2混合攻毒,利用Real-time PCR法定量测定攻毒后小鼠脾脏的病毒含量。【结果】成功构建了重组质粒pET32a-Cap和pET32a-VP2,表达出可溶性蛋白Cap和VP2,经GEM颗粒和饱和硫酸铵沉淀法纯化蛋白,获得的PCV2Cap蛋白质量浓度为1 213μg/mL,PPV VP2蛋白质量浓度为1 025μg/mL。两种蛋白混合乳化制苗后无相互免疫抑制作用,并且能够诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。免疫后42d,单苗免疫组和二联亚单位疫苗组PCV2ELISA抗体效价均能达到800以上,中和抗体达到32~38,PPV HI抗体效价均高于6,PPV中和效价高于300,并且诱导机体产生强烈的淋巴细胞增殖反应,提高IL-4和IFN-γ的mRNA表达水平。攻毒试验结果显示,免疫组小鼠脾脏中PCV2和PPV含量显著低于对照组,免疫组组间无显著性差异。【结论】利用大肠杆菌表达的PCV2Cap蛋白和PPV VP2蛋白制备的二联亚单位疫苗免疫ICR小鼠,其抗体水平与Cap、VP2单苗免疫水平相当,且对ICR小鼠有较好的免疫保护作用。

精液中猪细小病毒DNA三种提取方法效果比较

猪精液中含有高浓度的蛋白质,因此提取高纯度DNA较为困难;试验分别用水煮法、异硫氰酸胍法和Trizol法三种方法对连续稀释梯度猪精液提取猪细小病毒DNA,应用Taqman荧光定量PCR技术评价提取效果并加以对比。结果发现Trizol法可以提取出高纯度的DNA,但因Trizol试剂价格昂贵,不适用临床检测;比较另外两种方法,水煮法较异硫氰酸胍抽提法更为有效,是一种迅速、简便、经济、高效的DNA提取方法,适合于临床大量样品的检测。

猪细小病毒在PK细胞中的增殖过程

将猪细小病毒南京毒株1(N J-1)、南京毒株2(N J-2)和7909毒株接种于PK-15细胞,用免疫荧光检测方法研究了猪细小病毒增殖的基本特性与规律。在PK-15细胞中,3个毒株的增殖规律基本相似,均在感染后12 h即可检测到荧光,表明其子代病毒粒子产生,随后逐渐增多,在感染后48 h荧光几乎遍布所有细胞,随后荧光开始衰减,在84 h时病毒引起细胞大面积崩解,荧光呈现岛屿状分布。通过绘制其一步法生长曲线可知,在病毒感染后12 h,细胞培养液中的病毒TC ID50/mL为2.0左右,随后逐渐增高,感染后60 h 3种毒株的TC ID50/mL均达到最高,子代病毒粒子向细胞外释放也达到高峰,其后TC ID50逐渐下降。培养液中病毒粒子的半寿期为7 h。

豚鼠对猪细小病毒弱毒苗抗体反应的研究

用不同批次、不同剂量、不同保存时间的猪细小病毒N株弱毒苗接种豚鼠 ,观察豚鼠对PPVN株弱毒苗的抗体反应。结果 4种不同剂量和 3个不同批次的PPVN株弱毒苗接种豚鼠后第 14天均产生抗体反应 ,其PPVHI效价在 1∶16～ 1∶6 4之间 ,0 .1ml和 1ml剂量接种豚鼠产生的PPVHI抗体水平相近 ,抗体持续长达 12个月以上。在 4℃保存 0天、12个月和 - 2 0℃保存 2年、3年的PPVN株弱毒苗接种豚鼠 ,其PPVHI价在 1∶16～ 1∶32之间 ,说明该苗在 4℃至少能保存 12个月 ,- 2 0℃能保存 3年以上。比较了不同批次疫苗接种猪和豚鼠所产生的抗体反应 ,结果两者相似。用 3批引起豚鼠产生抗体反应的PPVN株弱毒苗接种 76 8头后备母猪 ,共产仔 7136头 ,其中健活仔 6 5 75头 ,平均每窝产健活仔 8.5 6头 ,产死仔仅 0 .73头。证明豚鼠是监测PPV弱毒苗抗体的首选实验动物。

银加强胶体金技术检测猪细小病毒的研究

本研究首次成功地建立了检测猪细小病毒（ＰＰＶ）抗原的银加强胶体金检测法（ＳＥＣＧＡ），并确定了操作流程中的最佳试验条件。应用该法对纯化ＰＰＶ抗原的最低检出量为０．３１２５ｎｇ／点，其敏感性分别为间接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和ＨＡ的８倍和１０００倍。特异性阻断试验和交叉反应试验证明ＳＥＣＧＡ具有较高的特异性。２０份样本ＳＥＣＧＡ的检测结果与病毒分离和鉴定结果完全相符。ＳＥＣＧＡ和间接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ对７７份样本检测的阳性率分别为８３．１％和８０．５％，其阳性符合率为９６．９％。研究结果表明本法具有经济、敏感性、特异性强等优点，可用于ＰＰＶ感染的特异诊断。为胶体金技术应用于畜禽传染病的诊断和研究奠定基础。

猪细小病毒分离、核酸探针研制及应用

采用分子克隆技术制备了ＰＰＶ－ＤＮＡ－Ｃ片段（ＰＰＶ－ＲＦ－ＤＮＡ，经ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄⅢ的双酶切片段，称为Ｃ片段）及含Ｃ片段的ＰＵＣ１９重组质粒（ＰＵＰ），利用地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｅｎｉｎ）标记，分别制备探针２和探针１。对猪细小病毒ＤＮＡ进行斑点杂交，两种探针均为阳性，而对照的猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒及ＰＫ－１５细胞的核酸均为阴性。并且后一种探针的敏感性高于前者，两种探针的ＤＮＡ检出限量分别为４０ｐｇ和４ｐｇ。同时对７例疑是猪细小病毒自然感染病理材料，经过处理后直接点样检测，均为阳性反应，而对照的健康猪组织，猪瘟病料，猪伪狂犬病病料检测结果为阴性。从７例自然病例中分离７株病毒。通过血凝试验、血凝抑制试验、免疫电镜技术及聚合酶链式反应等试验对分离毒进行了鉴定，结果分离到病毒均为猪细小病毒。结果表明，两种探针均具有高度的特异性、敏感性。这种方法对猪细小病毒感染的诊断、流行病学调查及检疫是一种有效、可靠的方法。

应用间接免疫荧光技术快速检测猪细小病毒抗原

用免疫荧光直接法检测组织病料中的猪细小病毒（ＰＰＶ）抗原时，因病毒粒子小，检出率较低。为提高检出率，又适于检验部门的应用，将猪细小病毒高免血清与胎儿组织中ＰＰＶ抗原形成特异的反应，再加兔抗猪ＩｇＧ荧光抗体，扩大抗原抗体反应的范围来提高检出率，建立了间接免疫荧光诊断技术。通过特异性试验，阻断试验，证明此技术特异敏感、快速（５小时内即可报告检验结果）用该技术对黑龙江和辽宁省９个猪场送检的３２头（窝）病例进行检测，阳性率为２５％。

应用ELISA双抗体夹心法检测猪细小病毒抗原的研究

研究建立了从胎猪脏器中检测猪细小病毒（ＰＰＶ）抗原的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法。试验方法的最佳工作条件为，抗体浓度１：４００，酶标抗体浓度１：５０。５４份胎猪样品阳性检出率为５９．３％，不同脏器的阳性检出率分别为，心３６．４％、肝脏７２．７％、脾脏５０％、肺脏６６．７％、肾脏６６．７％。

猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查

根据Genbank中PRRSV ORF7及PPVVP2基因序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV的RT-PCR及PCR方法。应用建立的方法对38个PCV2阳性病料进行了PRRSV及PPV检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和/或PPV混合感染情况,结果表明,15份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的39.4%;2份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占5.3%。另外,还有一定比例的三重感染,共3个样品,占7.9%。由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍。

猪细小病毒SC-1株VP2基因的克隆及生物信息学分析

根据PPV NADL-2株基因组序列设计了一对引物,以复制型DNA为模板,通过PCR 扩增出长约2.0 kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pUC19,构建重组质粒pPVP2,测序显示PPV-SC-1 VP2基因全长1 740 bp,共编码579个氨基酸.多序列比对结果显示,猪细小病毒VP2基因保守性强,仅存在个别的差异;密码子偏向性分析结果表明,PPV-SC-1 VP2基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,并且与PPV-SC-1 NS1在密码子的偏向性上具有相同的属性,主要偏向于使用以A结尾的密码子;氨基酸疏水性分析表明,PPV-SC-1 VP2蛋白在77～82、291～304、362～373、400～411、465～477等位点存在较明显的亲水区段;跨膜区结构分析显示该蛋白不存在显著意义的跨膜区;分析该蛋白的抗原位点可能位于60～68、81～88、266～275、351～357、398～404位点处.

猪瘟病毒 猪细小病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪伪狂犬病病毒多重PCR方法的建立以及初步应用

猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪伪狂犬病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。本研究通过设计4对针对这4种病毒的特异引物建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:其敏感性可达到CSFV 10 TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50 CSFV 10TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50。同时具有较好的特异性,对猪瘟病毒石门株、猪瘟病毒兔化弱毒株、PRV闽南A株、PPV弱毒疫苗株、PRRSV KY 35株及PRRSV B13株6个毒株均能扩增出相应的片段,而BVDV、BDV均未扩增出相应的片段。本方法的建立对于这4种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。

猪细小病毒和猪圆环病毒2型二重液相芯片检测方法的建立

作者拟建立检测猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二重液相芯片(xMAP)检测方法,以满足出入境检疫和临床高通量检测的要求。依据GenBank中PPV结构蛋白VP2基因及PCV2全基因序列,设计PPV和PCV2特异性探针、引物及探针互补序列,将探针与磁性微球偶联,对下游引物和探针互补序列标记生物素,采用不对称性二重PCR扩增靶序列,将PCR产物与偶联好的探针进行杂交,用液相芯片仪进行检测。通过对检测条件优化,建立检测PPV、PCV2两种病毒的二重液相芯片技术,并对临床样本进行检测。建立的PPV和PCV2二重液相芯片检测方法,特异性良好,该方法对PPV和PCV2基因拷贝数检测下限分别为1.53×104、2.58×102;对56份临床样品检测表明,该方法与单项PCR检测结果符合率为100%。成功建立了PPV、PCV2二重xMAP检测方法,该检测技术可用于出入境检疫和兽医临床检验。

高效佐剂对猪细小病毒和圆环病毒二联灭活疫苗的免疫增强效果

为评价高效佐剂VA5对猪细小病毒和猪圆环病毒二联灭活疫苗的免疫增强效果,将VA5与猪细小病毒、猪圆环病毒疫苗混合免疫BALB/c小鼠和豚鼠。结果显示,VA5佐剂能明显提高猪细小病毒血凝抑制抗体效价和血清病毒中和抗体效价,亦能提高猪圆环病毒ELISA抗体和中和抗体效价,并可降低二种抗原的使用量。VA5佐剂显著提高小鼠和豚鼠免疫后的淋巴细胞刺激指数。攻毒后,VA5佐剂处理组动物脾脏PCV2/PPV病毒载量明显低于不含高效佐剂的免疫组。VA5佐剂能提高猪细小病毒、猪圆环病毒疫苗在小鼠/豚鼠中的抗体效价,提高细胞免疫力,降低攻毒后的排毒。