不同病原菌刺激下三疣梭子蟹主要组织LGBP基因的时序表达

脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(lipopolysaccharide-β-1,3-glucan binding protein,LGBP)作为一种模式识别受体能够识别革兰氏阴性菌和真菌的细胞壁多糖成分脂多糖和β-1,3-葡聚糖,在甲壳动物的免疫系统中占有重要地位,为了解LGBP在蟹类动物抗菌免疫应答中的作用,采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,对分别经溶藻弧菌,酵母菌,溶-酵混合菌、金黄色葡萄球菌刺激6 h、12 h、24 h、48 h的三疣梭子蟹血细胞、肝胰腺、肌肉3种组织LGBP基因的相对表达量进行了检测。结果显示,LGBP基因在3种组织中的时序表达量总体趋势基本一致,呈现"上升-下降-再上升-下降"的趋势,各实验组在实验6 h时表达量均达到了峰值;不同病原菌刺激下LGBP基因在梭子蟹肝胰腺和血细胞中的表达量明显高于肌肉,且溶-酵混合菌刺激组织LGBP的表达量最高,酵母菌和溶藻弧菌刺激组次之,金黄色葡萄球菌组最低,说明LGBP主要参与蟹类抵抗革兰氏阴性菌和真菌侵入的免疫防御反应,但对革兰氏阳性菌也有一定的作用。

三疣梭子蟹P-gp蛋白在氟苯尼考代谢中的功能研究

为研究三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的转运功能,利用RACE扩增技术克隆得到abcb1(ATP-binding cassette transporter subfamily b1)基因全长序列,命名为Ptabcb1,cDNA全长为4923 bp,开放阅读框(ORF)为3522 bp,编码1172个氨基酸,具有2个疏水性的跨膜区(TMD)和2个核苷酸结合区(NBD),符合ABC转运蛋白的基本结构特征。序列比对结果显示,Ptabcb1基因与脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)abcb1基因同源性最高(73.32%)。系统进化树分析表明,Ptabcb1氨基酸序列与脊尾白虾紧密聚为一支。组织表达分布结果显示,Ptabcb1基因在所有组织中均有表达,其中在肝胰腺中的表达量最高。采用荧光原位杂交技术,利用合成目的基因Ptabcb1的杂交探针,通过荧光染色,追踪到Ptabcb1基因主要在肝胰腺的细胞质中表达。利用实时荧光定量技术探究肌注20 mg·kg^(-1)、40 mg·kg^(-1)和80 mg·kg^(-1)不同浓度的氟苯尼考(FLR)对Ptabcb1基因在三疣梭子蟹体内转录表达的影响;以及用10μM维拉帕米(verapamil,VER)注射三疣梭子蟹1 h后,再进行40 mg·kg^(-1) FLR的注射处理,探究FLR与VER联合注射给药对三疣梭子蟹Ptabcb1基因转录表达的影响以及转运活性的变化。结果显示,FLR在24 h内以浓度依赖的方式,通过促进Ptabcb1基因的转录上调,显著促进PtP-gp蛋白在转录水平上的转运活性;同时发现40 mg·kg^(-1) FLR与VER联合注射处理组与单独注射40 mg·kg^(-1) FLR处理组相比,在12 h之内强烈抑制FLR的外排,导致PtP-gp蛋白转运活性降低;12 h之后,PtP-gp蛋白转运活性逐渐恢复到对照组水平。此外,还发现三疣梭子蟹具有保守的P-gp蛋白介导的防御系统。研究结果可为进一步了解P-gp蛋白介导甲壳类动物解毒的分子防御机制提供依据。

中国对虾和三疣梭子蟹混养试验

于 1999～ 2 0 0 0年进行了中国对虾 (Penaeuschinensis)和三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatas)的混养试验。1999年的产量对虾为 388 92kg/hm2 ,梭子蟹为 90 9 31kg/hm2 ,纯收入和投入产出比为 3 6 4万元 /hm和 1∶1 98;2 0 0 0年的产量对虾为 412 5 0kg/hm2 ,梭子蟹为 72 2 2 5kg/hm2 ,纯收入和投入产出比为 2 5 5万元 /hm2 和 1∶1 2 3。两个年度的实验都取得了较好经济效益 ,混养的纯利润比对虾单养提高了 7～ 10倍 ,投入产出比提高 1～ 2 5倍。

苯并[a]芘(BaP)暴露对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)P4501A1、P-gp、HSP70基因表达的影响

以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)为实验对象,通过水体暴露方式对其进行Ba P持续染毒,随后进行消除试验,利用荧光定量q PCR技术研究三疣梭子蟹肝脏中细胞色素P4501A1(P4501A1)、P-糖蛋白(P-gp)、热休克蛋白70(HSP70)等相关基因表达量随Ba P暴露时间和暴露剂量的变化特征。结果显示:Ba P暴露对P4501A1、P-gp、HSP70基因的表达均起诱导作用,且对P4501A1的诱导最为显著(P<0.05);消除期间P4501A1、P-gp、HSP70基因的表达量显著降低,且P4501A1表达量变化更为明显(P<0.05)。实验结果表明Ba P对三疣梭子蟹肝脏P4501A1基因诱导作用最为显著,可作为Ba P暴露的敏感生物标志物,用以监测水环境中多环芳烃的污染。

三疣梭子蟹血淋巴6种免疫指标对病原菌刺激的响应

为进一步了解三疣梭子蟹对病原菌侵入的免疫调节机制,分别采用0.1 m L浓度约为107cells·m L-1的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)菌悬液注射三疣梭子蟹,在实验第1、2、3、4、5、6和7 d分别检测蟹血细胞总数(THC)、血细胞吞噬指数(PI)及呼吸爆发、总酚氧化酶(POT)、丝氨蛋白酶(SP)和血清酚氧化酶(PO)活性等6种免疫相关指标的变化。结果显示,两种病原菌刺激后三疣梭子蟹血淋巴6种免疫相关指标均出现了极显著的变化(P<0.01),不同菌刺激后同一免疫指标的变化趋势基本相同但不同步。THC呈下降-上升-恢复的变化趋势,而PI、呼吸爆发、POT、SP和PO等活性均呈迅速上升-逐渐下降-恢复的变化趋势。说明低剂量病原菌的刺激确实可以诱导三疣梭子蟹血淋巴免疫指标的活性,但对各免疫指标的诱导强度及免疫指标的响应时间各不相同。

锯缘青蟹和三疣梭子蟹幼体饵料的研究

采用３种单细胞藻类、３种动物性饵料和４种人工饵料，分别喂养不同发育期的锯缘青蟹和三疣梭子蟹幼体，根据其变态速度和存活率比较各种饵料的饲喂效果。