BAT3过表达缓解由PrP106-126毒性多肽诱导的神经元凋亡

拟检测BAT3蛋白过表达对由PrP106-126毒性多肽引起的神经元凋亡现象的影响。首先通过免疫荧光、CCK8细胞活性检测试剂盒和免疫印迹检测带FITC标签的PrP106-126-FITC毒性多肽的生物学毒性。分别用PrP106-126-FITC和PrP106-126神经毒性多肽处理原代神经元和Neuro2a细胞,通过免疫荧光技术和免疫印迹方法分别检测受刺激后的原代神经元和Neuro2a细胞中BAT3表达的变化情况。通过脂质体转染方法将已经构建好的pcDNA-3.1-HA-BAT3质粒转染进入原代神经元,用CCK8检测细胞活性;以同样方式将质粒转染进入小鼠神经瘤细胞系Neuro2a,用TUNEL凋亡检测试剂盒分析经BAT3转染或对照组的N2a细胞的凋亡水平;Western blot检测PrP106-126神经毒性多肽处理前后,胞质内细胞色素C和Bcl-2的变化,进一步了解BAT3在神经元凋亡中发挥作用的机制。结果显示,PrP106-126-FITC和PrP106-126神经毒性多肽具有相似的神经毒性。受到多肽刺激之后,无论在原代神经元还是传代细胞系Neuro2a中,BAT3都发生核输出现象,BAT3从细胞核转移进入细胞质。BAT3的过表达使受到PrP106-126毒性多肽刺激的神经元的细胞活性有所提高,Neuro2a的细胞凋亡现象减轻,同时抑制了由PrP106-126毒性多肽引起的细胞色素C的过度释放并且维持细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的稳定。BAT3蛋白的表达缓解PrP106-126毒性多肽对神经细胞造成的凋亡现象,为进一步阐释该蛋白质对朊病毒引起的神经元损失的治疗作用机制提供了依据。

自由基清除剂对PrP106-126诱导的分化PC12细胞线粒体膜电位影响的研究

目的从观察线粒体膜电位角度观察探讨自由基清除剂依达拉奉对PrP106-126诱导的分化PC12细胞损伤的保护作用,从而寻找更加有效的朊蛋白病的治疗方法。方法应用线粒体特异性染料罗丹明123荧光标记技术,通过激光共聚焦显微镜观察不同浓度的依达拉奉对PrP106-126诱导的分化PC12细胞线粒体膜电位的影响。结果经图象扫描,每个细胞得到20个荧光强度变化数值,并对其荧光变化值进行分析。表明依达拉奉可以使感染PrP106-126后的分化PC12细胞线粒体膜电位逐渐恢复正常。结论依达拉奉对PrP106-126诱导的分化PC12细胞具有抗氧化损伤保护作用,并且提示线粒体膜电位的改变是依达拉奉神经细胞保护作用的重要环节之一。

多肽PrP106-126对培养神经细胞朊蛋白基因表达的影响

神经细胞是传染性海绵状脑病(transmissiblespongiformencephalopathies,TSEs)的重要靶细胞,PrP106-126是研究TSEs致病机理的理想工具,对PrP106-126作用的培养神经细胞模型进行研究,有利于了解朊蛋白的功能和探讨TSEs的分子致病机制。本研究利用PrP106-126构建了大脑皮质和小脑颗粒神经元作用模型,对神经细胞的存活和朊蛋白基因的表达进行了研究。结果表明:PrP106-126作用于培养神经细胞导致其存活率的显著下降;大脑皮质神经元经PrP106-126处理后,与SCR处理组和对照组相比,基因表达的量明显下降,处理后的小脑颗粒神经元也有类似的情况出现,两者之间下降的幅度和时间不同。我们的研究结果为研究朊蛋白在TSEs发生中的作用和深入了解TSE的分子致病机制提供了基础数据。

PrP106-126诱导的小鼠成神经瘤N2a细胞NF-κB激活及神经毒性研究

PrP106-126诱导的神经毒性机制仍不清楚。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用WesternBlot方法首次发现PrP106-126导致核转录因子NF-κB的亚单位p65蛋白转移到细胞核内,激活了NF-κB细胞信号分子。转核抑制剂NF-κB SN50预处理细胞减弱了PrP106-126诱导的NF-κB激活程度;并且DNA Ladder凋亡检测及Annexin V-FITC和PI双染流式细胞凋亡检测发现,NF-κB SN50能够抑制p65蛋白转核,在一定程度上也抑制了PrP106-126对N2a细胞的神经毒性效果。结果表明NF-κB信号分子参与了PrP106-126的神经毒性,且NF-κB信号分子的激活对N2a细胞具有促凋亡作用。PrP106-126激活N2a细胞NF-κB信号分子以及NF-κB促凋亡功能的体外研究对于阐明朊病毒病致病机理具有重要意义。

黄芩素对朊蛋白PrP106-126片段引起的神经毒性保护作用研究

目的利用PrP106-126多肽感染的SH-SY5Y细胞,探究黄芩素对PrP106-126引起的神经毒性保护作用及其机制。方法将SH-SY5Y细胞按照不同的处理分成细胞对照组、药物对照组、PrP106-126对照组、PrPScr对照组、黄芩素作用组。采用细胞病变法及MTT法检测PrP106-126对SH-SY5Y细胞形态和活性的影响,采用MTT法检测黄芩素抑制PrP106-126多肽神经毒性的药效,TUNEL法检测黄芩素对PrP106-126多肽所致细胞凋亡的影响。结果与细胞对照组比较,PrP106-126感染的SH-SY5Y细胞形态明显不同,可见细胞折光性变强,细胞聚集呈破碎样。与PrPScr对照组比较,PrP106-126感染的细胞抑制率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与PrP106-126对照组比较,在治疗模式和预防模式中黄芩素作用组细胞增殖率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与细胞对照组比较,PrP106-126对照组的细胞凋亡指数(AI)明显升高(P<0.01);与PrP106-126对照组比较,黄芩素作用组的细胞AI明显降低(P<0.05)。结论黄芩素在体外对朊病毒具有治疗和预防作用,其作用机制可能与细胞凋亡有关。

PrP106-126对BV-2小胶质细胞NO含量影响及作用机制

朊蛋白多肽PrP106-126可激活小胶质细胞并产生活性物质。探讨PrP106-126作用于BV-2小胶质细胞对NO生成状况影响,从酶学角度检测其作用机制。在细胞培养液中加入50μmol.L-1PrP106-126,培养48 h后检测培养液NO含量,采用实时定量RT-PCR检测细胞内iNOs和nNOs在mRNA表达水平。结果表明,PrP106-126显著提高细胞培养液中NO含量(9.34倍,P<0.01),且iNOs和nNOs表达水平均极显著提高(11.60倍和4.36倍,P<0.01),从而为解释朊病发生机制提供基础数据。

PrP106-126诱导的N2a细胞神经毒性中神经营养因子受体p75^NTR的表达变化研究

神经元死亡是朊病毒病的主要病理学特征。朊蛋白多肽PrP106-126能够对神经细胞表现神经毒性,引起细胞凋亡。细胞表面蛋白神经营养因子受体p75NTR的胞外区域可以与PrP106-126结合并产生促凋亡作用。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术,以及DNA Ladder和AnnexinV-FITC/PI双重染色流式细胞凋亡检测技术对p75NTR介导的PrP106-126神经毒性分子机制进行了研究。结果发现在PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡过程中,p75NTR的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高,以p75NTR多克隆抗体sc-6189阻断PrP 106-126与p75NTR的相互作用后,减弱了PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡效果。该研究揭示了PrP106-126诱导的N2a细胞毒性中p75NTR受体的表达变化,为解释朊病毒病的发病机制提供了重要数据。

PrP106-126对大脑皮质神经元和星形胶质细胞朊蛋白基因表达的影响

采用实时荧光定量RT-PCR的方法,对PrP106-126处理的大脑皮质神经元和星形胶质细胞模型进行了朊蛋白基因表达相对定量的研究。大脑皮质神经元经PrP106-126处理后,与SCR处理组和对照组相比,基因表达量明显下降。PrP106-126处理的星形胶质细胞与对照组和SCR处理组相比,朊蛋白基因的表达量显著升高。该试验结果为深入了解TSEs的分子致病机制和正常朊蛋白的功能提供了基础数据。

PrP106-126神经毒性多肽对原代神经元造成病理性损伤

目的系统地研究PrP106-126神经毒性多肽对原代神经元造成的损伤。方法使用出生24 h内的SD乳鼠分离培养原代神经元,经过PrP106-126处理后,利用免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白的变化;利用透射电镜观察功毒后原代神经元亚细胞结构的变化情况;利用流式细胞仪检测细胞活性;利用免疫荧光技术观察细胞凋亡情况。结果随着PrP106-126刺激原代神经元的时间延长,抑制凋亡蛋白的表达量不断下降,促凋亡蛋白的表达量不断升高;透射电镜显示,经过多肽刺激的原代神经元的细胞器结构有不同程度的损伤,细胞胞浆内出现大小不等的单层或多层空泡结构;TUNEL细胞凋亡检测和Annexin V-FITC细胞活力检测试剂盒的检测结果都表明,经多肽刺激后,原代神经元的细胞活力显著下降,并有大量神经元发生凋亡。结论 PrP106-126神经毒性多肽激活促凋亡信号通路,造成细胞内的平稳紊乱和超微结构损伤,诱导原代神经元发生凋亡,为朊病毒疾病研究模型的建立提供全面可靠的证据。

朊蛋白多肽PrP106-126对小鼠成神经瘤细胞N2a的毒性研究

采用Annexin V-FITC/PI双重染色的流式细胞检测和细胞凋亡的形态学观察,探讨了朊蛋白多肽PrP106-126对小鼠成神经瘤细胞系N2a细胞的毒性作用。结果表明:15、25和50μmol/L浓度的PrP 106-126作用于N2a细胞24 h均引起了细胞明显的形态学变化,提高了细胞凋亡率(P<0.05),且浓度越大,凋亡效果越明显;在浓度为25μmol/L时,PrP 106-126作用N2a细胞48 h引起的毒性作用明显大于24 h,而100μmol/L PrP 106-126作用N2a细胞12 h并未引起细胞凋亡(P>0.05)。试验还表明PrP 106-126对神经细胞产生的毒性是淀粉样纤维物质作用细胞逐渐造成的结果。

自由基清除剂对PrP106-126诱导的分化PC12细胞存活率影响的研究

目的从细胞存活率角度观察探讨自由基清除剂—依达拉奉对PrP106-126诱导的分化PC12细胞损伤的保护作用,从而寻找更加有效的朊蛋白病的治疗方法。方法应用MTT法,体外观察不同浓度的依达拉奉对PrP106-126诱导的分化PC12细胞存活率改变的影响。结果不同浓度的依达拉奉(15、30、45、60μmol/L)对PrP106-126诱导的分化PC12细胞均有保护作用,随着浓度的增加,保护作用更加明显,呈量效和时效依赖关系。结论依达拉奉对PrP106-126诱导的分化PC12细胞具有抗氧化损伤保护作用,其作用可以通过提高感染PrP106-126后的分化PC12细胞的存活率而表现出来。

PrP106-126对星形胶质细胞层黏连蛋白和纤黏连蛋白表达的影响

星形胶质细胞增生是朊病毒病早期的主要病理学特征。PrP106-126(prion protein peptide106-126)具神经毒性,导致星形胶质细胞增生。层黏连蛋白(laminin,LN)和纤黏连蛋白(fibronectin,FN)是星形胶质细胞胞外基质的主要成分。利用PrP106-126和PrP106-126制备的小胶质条件培养基(conditioned medium from microglia,MiCM)分别作用于体外培养的星形胶质细胞,应用RT-PCR和Westernblot技术探讨PrP106-126对星形胶质细胞的增殖及其胞内LN、FN表达的影响。试验分为5个处理(空白对照、Scr对照、PrP106-126、MiCM、MiCMPrP106-126)。结果表明,PrP106-126可促进星形胶质细胞增殖、LN和FN的表达,但促增殖和FN表达作用有赖于活化小胶质细胞细胞因子的共同参与。

PrP106-126多肽诱导凋亡细胞中14-3-3β的降解

本研究将PrP106-126多肽和HeLa细胞共孵育4h和8h,采用Hoechst染色分析发现PrP106-126诱导凋亡细胞细胞核出现不同程度的染色质浓集,固缩及碎裂的细胞凋亡征象。Western blotting检测发现PrP106-126诱导细胞中的多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)降解,提示PrP106-126通过caspase3途径引起细胞凋亡现象。PrP106-126诱导的细胞中14-3-3β在不同孵育时间也出现降解,而Real-time PCR检测14-3-3βmRNA未发生变化。本研究证明PrP106-126通过caspase3诱导HeLa细胞凋亡,并可导致抗凋亡蛋白14-3-3β的降解而加速凋亡的形成。

自由基清除剂对PrP106-126诱导的分化PC12细胞形态学的影响

目的:从形态学角度观察探讨自由基清除剂对PrP106-126诱导的分化PC12细胞损伤的保护作用。方法:应用光镜、激光共聚焦显微镜技术和MTT法,体外观察不同浓度自由基清除剂对PrP106-126诱导的分化PC12细胞形态学及细胞存活率改变的影响。结果:不同浓度的依达拉奉(15、30、45、60μmol·L-1)对诱导分化的PC12细胞均有保护作用,其保护作用呈剂量依赖关系。激光共聚焦显微镜双荧光标记结果显示,随着依达拉奉浓度的增高,PrP106-126诱导的分化PC12细胞坏死及凋亡的程度降低。结论:依达拉奉对PrP106-126诱导的分化PC12细胞具有抗氧化损伤保护作用。

Fe^(3+)与PrP106-126共同诱导下N2a细胞的氧化应激状态

利用PrP106-126多肽的神经毒性,结合Fe3+对细胞氧化应激可能的诱导作用,建立N2a细胞的氧化应激模型,以研究氧化应激在Prion疾病过程中的作用,及其诱导神经细胞退行性损伤的机制。试验表明,通过毒性多肽PrP106-126与Fe3+共同作用,模拟神经细胞的氧化应激状态是可行的。效果较佳的攻毒浓度和攻毒时间分别是不高于50μmol/L的毒性PrP106-126多肽,不高于500μmol/L的Fe3+,最佳攻毒时间为12h。

PrP106-126毒性多肽影响小胶质细胞IL-1β、TNF-α的mRNA表达量变化的研究

体外合成的人PrP106-126毒性多肽具有PrPSc类似的特性,如富含β折叠,具有部分蛋白酶抗性,可以在脑组织内沉积形成淀粉样斑块等等。因此PrP106-126可作为替代PrPSc研究TSE发病机制的理想模型。PrP106-126对神经元的损伤作用可能主要通过两种途径:一方面它可与神经元表面的相关受体相结合通过信号转导途径直接对神经元造成损伤,另一方面它可激活小胶质细胞产生炎性介质或NO等毒性物质间接引起神经元凋亡。激活的小胶质细胞主要产生IL-1β、TNF-α两种炎性介质,这两种细胞因子的持续产生可致使神经元凋亡。本研究旨在对PrP106-126多肽作用小胶质细胞过程中,IL-1β、TNF-α的mRNA表达量随时间变化的规律,为阐明TSE发病过程中,小胶质细胞促进神经元凋亡的作用机制提供基础数据,并为一定程度上抑制小胶质细胞激活,减轻其对神经元的损伤作用奠定理论基础。

PrP106-126诱导小胶质细胞BV-2抗氧化性能的变化

小胶质细胞活化是朊病的病理学特征之一。朊蛋白多肽PrP106-126具神经毒性,是研究异常腕蛋白(PrPSc)的理想工具。为探讨PrP106-126对小胶质细胞氧化压力的影响。本研究以小胶质细胞BV-2为细胞模型,PrP106-126作用48h,应用MTT和流式细胞仪检测细胞的活化情况,应用分子探针技术对细胞的氧化压力(reactive oxygen species,ROS)进行检测,并通过荧光定量RT-PCR对与ROS相关的酶的mRNA表达进行了测定。结果表明PrP106-126显著促进小胶质细胞BV-2的活化,并提高胞内的ROS水平;定量RT-PCR显示,PrP106-126显著降低细胞SOD-1(P<0.01)表达水平、提高胞内Cat(P<0.01)的表达水平;对Grx、Trx-1、和Trx-2mRNA的表达水平有升高的趋势,但未达到显著水平(P>0.05),对SOD-2、GPx、GR无显著性影响(P>0.05)。从分子水平初步阐明小胶质细胞ROS升高的机理。

REST缓解由PrP106-126毒性多肽诱导的原代神经元突触和神经纤维的损伤

为了检测REST蛋白过表达或干扰对由PrP106-126毒性多肽引起的原代神经元纤维的影响,本试验通过免疫荧光技术和免疫印迹方法分别检测受PrP106-126刺激后的原代神经元中REST表达的变化情况。通过脂质体转染方法将已经构建好的pCMV-HA-REST质粒转染进入原代神经元,或利用靶向REST的小干扰siRNA技术干扰原代神经元中REST蛋白的表达。用PrP106-126毒性多肽刺激转染了REST过表达或干扰质粒的原代神经元,利用免疫印迹检测突触后蛋白PSD-95的变化情况;利用免疫荧光观察突触后蛋白和神经纤维的损伤情况。结果显示,受到多肽刺激后,REST从神经元的胞浆向胞核转移的同时表达量也逐渐增加,24h时达到顶峰,之后缓慢减少。生理情况下,过表达REST促进突触后蛋白PSD-95的表达;病理情况下,REST的过表达减轻由毒性多肽引起的突触损伤、神经纤维断裂。相应地,干扰REST后,加剧毒性多肽对神经纤维的损伤。结果表明,REST蛋白的过表达缓解PrP106-126毒性多肽对原代神经细胞造成的病理性损伤,为进一步阐释REST对朊病毒及相关神经退行性疾病引起的病理性损伤的治疗作用和神经保护机制提供了理论依据。

REST缓解由PrP106-126毒性多肽诱导的原代神经元死亡

为检测神经元限制性沉默因子(REST)蛋白过表达或干扰对由PrP106-126毒性多肽引起的原代神经元死亡的影响,首先通过脂质体转染法将已经构建好的pCMV-HA-REST质粒转染原代神经元,或利用靶向REST的小干扰siRNA技术干扰原代神经元中REST蛋白的表达。用PrP106-126毒性多肽刺激构建好的REST过表达或干扰的原代神经元,利用Annexin V-FITC试剂盒检测细胞活性;利用TUNEL和Hoechest试剂盒,在激光共聚焦显微镜下直接观察细胞凋亡情况;在透射电镜下观察原代神经元亚细胞结构的变化和损伤情况;使用JC-1线粒体膜电位试剂盒检测线粒体膜电位的改变,同时检测凋亡相关蛋白FOXO1、细胞色素C以及Caspase-3的变化情况。结果显示,受到多肽刺激后,REST的过表达可减轻由毒性多肽引起的神经元死亡、神经元空泡化、细胞器损伤,抑制线粒体膜电位的改变,维持促存活蛋白FOXO1的表达,阻止线粒体向胞浆中释放细胞色素C以及Caspase-3的激活。相应地,干扰REST后,可加剧毒性多肽对神经元的损伤并抑制FOXO1的表达。这表明REST蛋白的过表达可缓解由PrP106-126毒性多肽引起的神经元死亡,对神经元起保护作用,为进一步阐释REST对朊病毒及相关神经退行性疾病引起的病理性损伤的治疗作用和神经保护机制提供依据。

PrP106-126对原代大脑皮质神经元的毒性作用

目的:探讨PrP10 6- 12 6对神经元的毒性作用。方法:原代培养的皮质神经元暴露于合成多肽PrP10 6 -12 6,观察细胞存活率的变化,采用流式细胞术检测有无凋亡的发生,用免疫印迹法检测caspase 3的活性。结果:在PrP10 6 -12 6的作用下,神经元存活数较对照组减少,随着作用时间的延长,存活率明显下降。在PrP10 6- 12 6作用下神经元的凋亡比例明显增加,PrP10 6- 12 6组凋亡细胞为2 4.93 % ,对照组为6.95 %。与对照组比,PrP10 6 -12 6组在培养第6、8、10天时均有较明显的caspase- 3表达,且伴有caspase 3的活化。结论:PrP10 6- 12 6对原代培养的皮质神经元有毒性作用,呈时间依赖性。PrP10 6 -12 6毒性作用涉及了细胞凋亡机制,激活caspase -3诱导细胞凋亡可能是途径之一。