慢乙肝治疗性疫苗IFN-γ-preS1表位分析及卡介苗重组穿梭质粒pMV261构建

目的运用生物信息学方法分析预测乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的前S1(preS1)蛋白和重组IFN-γ-preS1蛋白的T、B细胞优势表位,构建卡介苗(Bacille calmette-guérin,BCG)重组pMV261穿梭质粒。方法NCBI数据库中获取γ干扰素(Interferonγ,IFN-γ)和preS1的氨基酸序列,应用I-TASSER构建三级结构并对重组蛋白进行免疫模拟。利用SnapGene软件将重组IFN-γ-preS1蛋白全长基因插入大肠埃希菌-BCG穿梭质粒pMV261中,构建BCG重组pMV261。结果preS1蛋白与重组IFN-γ-preS1蛋白分别由118和299个氨基酸组成。IFN-γ蛋白与特异性抗原preS1蛋白进行融合后,preS1蛋白的亲水性、稳定性均未发生改变,其二级结构和三级结构亦能正常表达。preS1蛋白经重组后,其B细胞抗原表位由preS1蛋白的4~18位、25~40位和41~59位氨基酸分别变为重组IFN-γ-preS1蛋白的185~199位、207~221和222~242位氨基酸,其余未发生改变;其Th细胞抗原表位、细胞毒性T(CTL)细胞抗原表位与重组IFN-γ-preS1蛋白的Th细胞抗原表位、CTL细胞抗原表位相比,仅位置改变,其余未发生改变。琼脂糖凝胶电泳模拟结果显示,重组IFN-γ-preS1蛋白大小为897 bp,空载质粒大小为4488 bp,构建的BCG重组pMV261穿梭质粒大小为5359 bp。免疫模拟结果表明,该重组疫苗可激活细胞免疫和体液免疫。结论BCG重组pMV261穿梭质粒的构建,为进一步研究慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的BCG治疗性疫苗奠定了理论基础。

早期血清前S1抗原(PreS1)对干扰素α治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎儿童HBsAg阴转的预测价值

目的探讨血清前S1抗原(PreS1)水平作为预测干扰素α(IFN-α)治疗48周的HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)儿童HBsAg转阴指标的价值。方法纳入2016年6月—2020年1月接受IFN-α治疗48周的88例1~16岁HBeAg阳性CHB患儿,每3个月评估患儿的HBsAg定量(qHBsAg)、HBV DNA定量、ALT等,并采用磁微粒化学发光免疫分析法(双抗体夹心法)检测PreS1水平。根据IFN-α治疗48周终点时HBsAg是否转阴分为转阴组(n=17)和未转阴组(n=71)。计量资料的两组间比较采用Mann-Whitney U检验,计数资料的两组间比较采用χ^(2)检验或Fisher精确检验。用Spearman秩相关检验评估PreS1水平和其他生物标志物之间的关系。用受试者工作特征曲线下面积(AUC)评估不同标志物对IFN-α治疗48周终点HBsAg转阴的预测价值。结果PreS1水平与血清qHBsAg、HBV DNA水平呈正相关(r值分别为0.912、0.535,P值均<0.05)。基线时,PreS1/qHBsAg比值(AUC=0.694)较PreS1水平(AUC=0.530)和qHBsAg水平(AUC=0.514)具有较好的48周HBsAg转阴预测价值。治疗12周的PreS1水平(AUC=0.867,P<0.001)和PreS1/qHBsAg比值下降量(AUC=0.800,P=0.002)均对48周终点时HBsAg转阴有很好的预测作用。治疗24周的PreS1水平、qHBsAg水平和HBV DNA均可有效预测第48周的HBsAg转阴,AUC分别为0.917、0.949和0.762(P值均<0.001)。结论治疗12周时血清PreS1水平和PreS1/qHBsAg比值下降量是预测IFN-α治疗期间CHB患儿HBsAg转阴的候选标志物。

乙肝PreS1抗原及抗体检测在乙肝感染诊断中的应用

目的研究乙肝PreSl抗原及抗体检测对乙肝感染状态诊断的作用。方法选取乙肝两对半检测结果常见的几种模式样本,使用酶联免疫法检测乙肝PreS1抗原及抗体。结果乙肝PreSl抗原阳性在大三阳样本中的比例为92%,PreS1抗原阴性比例为8%.PreS1抗原阳性在小三阳样本中的比例为9%,在单纯表面抗原阳性样本中的比例为5%,在表面抗原及核心抗体阳性中的比例为17%。结论乙肝PreS1抗原在大三阳病人有部分检测不出,说明部分大三阳病人并非处于病毒复制期,无病毒传播危险。而在单纯乙肝表面抗原阳性、小三阳、表面抗原及核心抗体阳性病人有部分可检测出PreS1抗原,说明此三类病毒标志物携带病人有一部分存在病毒复制,可能处于传染期。PreS1抗原阳性及抗体检测可作为乙肝两对半检测的补充用于初步了解乙肝病人是否处于活动期,并可以早期发现乙肝感染病人。

乙型肝炎病毒血清标志物与PreS1抗原的关系

目的:了解PreS1与HBVM和HBV DNA的关系及其临床应用价值。方法:对306例临床血清采用ELISA方法检测HBVM和PreS1,荧光定量PCR法检测HBV DNA。结果:中HBeAg阳性146例,其中前S1阳性127例阳性率88.1%,HBeAg阴性共160例,其中前s72例阳性率45%,HBeAg阴性血清160例前s多数存在于抗HBe阳性血清中,阳性率40.6%。结论:PreS1比HBeAg更能较好反映病毒存在和复制状态.HBVM、PreS1和HBV DNA联合检测,更有利于乙肝病情监测和疗效评估。

哺乳动物细胞分泌的乙型肝炎病毒表面S+PreS1融合抗原的理化和生物学性状

研究了哺乳动物细胞(转基因GdSS1-18细胞系)分泌的乙型肝炎(乙肝)病毒表面S+PreS1融合抗原(SS1)纯品的理化及生物学性状,结果表明:经HPLC柱层析呈现一个对称峰,证明HBsAg颗粒所带电荷的均一性;SDS-PAGE出现P24及P27条带,未出现Gp30的条带,凝胶扫描分析其各条带分别各占22 3%、77 7%、0%;West ernblot试验证实,P27和Gp30能与S及S1抗体结合,而P24条带仅能与S抗体结合,表明S、PreS1是特异性条带;N-末端的氨基酸序列与所用目的基因编码的序列相同;乙肝SS1融合抗原在4℃储存较稳定。动物实验结果表明:与单纯含S基因的参比疫苗相比,含SS1融合基因疫苗免疫Balb/c小鼠既产生S抗体,又产生S1抗体,S抗体的ED50滴度与参比疫苗相似,S1抗体产生早于S抗体。

核酸免疫可特异地诱发小鼠对乙型肝炎病毒表面抗原S+PreS1免疫反应

运用改造后的乙型肝炎病毒表面抗原Ｓ＋ＰｒｅＳ１融合基因（将ＰｒｅＳ１区肝细胞受体结合位点（２１－４７ａａ）编码基因融合到Ｓ蛋白Ｃ端２２３位残基下游），构建了一系列真核表达载体，并在ＣＨＯ细胞上有效表达了分泌型的、具有Ｓ＋ＰｒｅＳ１双重抗原性的融合蛋白颗粒。用上述质粒ＤＮＡ肌肉免疫Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠，成功地检测到了抗－ＨＢｓ和抗－ＰｒｅＳ１抗体，加强免疫能显著改善免疫效果。本研究还建立了检测抗－ＰｒｅＳ１的竞争抑制法和羊抗人ＨＢｓＡｇ封闭法，两种方法符合率达９６％，但后者更为敏感。用羊抗人ＨＢｓＡｇ封闭法测得抗－ＰｒｅＳ１滴度最高可达１：１２８０以上。

用T7噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒PreS1相互作用蛋白

目的:用T7噬菌体筛选系统筛选乙型肝炎病毒PreS1的相互作用蛋白。方法:应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到的乙型肝炎病毒PreS1作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行生物筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索。结果:经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与乙型肝炎病毒PreS1相互作用的蛋白可能为:细胞色素C氧化酶1(Cytochrome c Oxidase Subunit I,COX1)。结论:T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨PreS1的致病机制提供重要依据。

PreS1抗原与HBeAg联合检测用于预测HBV-DNA的水平

目的:联合检测慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者的血清前S1(PreS1)抗原和乙肝e抗原(HBeAg)两项指标,判断其与HBV-DNA定量的相互关系。方法:采用双抗体夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)法(两步法)检测PreS1抗原,双抗体夹心ELISA法(一步法)检测HBeAg,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测HBV-DNA。结果:在335例慢性HBV携带者患者中,PreS1抗原阳性率为42.7%,HBeAg阳性率为36.4%,HBV-DNA阳性率为53.4%。在179例HBV-DNA阳性患者中,HBeAg阳性109例(60.9%);156例HBV-DNA阴性患者中,HBeAg阴性143例(91.7%)。在179例HBV-DNA阳性患者中,PreS1抗原阳性89例(49.7%);在156例HBV-DNA阴性患者中,PreS1抗原阴性102例(65.4%)。PreS1和HBeAg双阳性的感染者HBV-DNA阳性率为93.8%(45/48);在PreS1和HBeAg双阴性的感染者中,HBV-DNA阳性率仅为22.0%(26/118)。结论:HBeAg与HBV-DNA的相关性比PreS1抗原与HBV-DNA的相关性高。PreS1和HBeAg双阳性的感染者HBV的复制程度高,而双阴性的感染者复制程度较低。因此,PreS1抗原与HBeAg联合检测可用于预测HBV-DNA的水平。

乙肝病毒PreS1抗原的临床应用

目的:评价检测乙肝病毒PreS1抗原的临床应用价值.方法:将临床送检的1000份乙肝病毒表面抗原(HBsAg阳性的血清标本进行PreS1抗原检测,同时用FQ-PCR进行HBV-DNA测定.结果:PreS1总阳性率为52.0%,HBV-DNA阳性率为50.8%,HBeAg阳性率为21.0%.PreS1总阳性率明显高于HBeAg阳性率.PreS1与HBV-DNA的总符合率为94.4%.结论:PreS1抗原作为乙肝感染和复制的血清学指标敏感性高于HBeAg,对提示乙肝患者的病情发展和转归有重要临床意义.PreS1可以作为一项新的乙肝病毒复制的传染性指标.

可捕获HBV的preS1单克隆抗体的制备及性质初探

用天然乙型肝炎病毒（HBV）颗粒（Dane颗粒和管状颗粒）和HBV前S1（preS1）区基因工程重组蛋白GST-preS1联合免疫Balb/c小鼠，经杂交瘤技术制备了7株单克隆抗体（mAb），采用ELISA、免疫捕获PCR等方式鉴定其有关特性.各株mAb分别为IgG1和IgG2a，轻链均为κ型.腹水mAb的滴度为1×10^7-1×10^9.用间接法ELISA显示，所有7株preS1 mAb均可以识别HBV天然抗原，其中mAb 4D11与HBV天然抗原的结合能力最强.通过竞争抑制法ELISA检测推断preS1（21-47）上至少含有两个B细胞表位，mAb 4D11、1G5、7B6和7H11具有共同的B细胞抗原识别位点；mAb 3H5、6F1和2A6识别另外一个位点.本研究获得的可与HBV天然抗原结合的preS1单抗为HBV preS1检测试剂的研制提供了重要工具，对HBV preS1具有中和免疫活性抗原的设计及相关研究有重要帮助.

乙型肝炎病毒PreS1抗原、丙氨酸氨基转移酶和HBV-DNA相关性分析

目的:探讨PreS1抗原、丙氨酸氨基转移酶(ALT)分别与HBV-DNA定量表达的相互关系。方法:选取住院和门诊受检者4439例血清标本,分别用荧光定量PCR法检测HBV-DNA,ELISA法检测PreS1抗原,速率法检测ALT;从其中选取HBV-DNA阳性186例作为定量检测对象,并计算PreS1抗原相对滴度值和HBV-DNA常用对数值。结果:4439例标本中PreS1抗原阳性率为21.27%,ALT异常率为21.36%,与HBV-DNA的阳性率(21.76%)都无显著差异(P>0.05);186例HBV-DNA阳性标本中PreS1相对滴度(17.53±14.17)、ALT(64.96±175.89)与HBV-DNA定量对数值(6.27±1.14)均不相关。结论:检测PreS1抗原可以作为HBV病毒感染和复制的较好的新指标,但不能说明复制量情况;联合检测ALT对HBV感染患者的诊断、治疗有重要的价值。

HBV DNA与preS1抗原均阳性患者HBeAg阴性的原因探讨

目的探讨导致HBVDNA阳性、preS1抗原阳性标本ELISA检测HBeAg阴性的原因。方法筛选76例HBeAg阴性而preS1及HBVDNA阳性的血清分别进行(1)血清1∶100稀释后重新用ELISA测定HBeAg;(2)用单克隆抗-HBe固相ELISA检测血清HBeAg/IC;(3)用寡核苷酸探针斑点杂交法测定HBV前C区的基因突变。结果76份血清稀释后重测5例HBeAg阳性;38例HBeAg/IC阳性;24例HBV前C区存在基因突变。结论后带效应、HBeAg/IC、前C区基因突变是HBVDNA阳性血清HBeAg阴性的主要原因;HBVDNA阳性、HBeAg阴性标本多为野生型毒株感染,只是由于形成了HBeAg/IC使常规ELISA检测不出HBeAg。

荧光定量PCR检测HBV DNA与血清HBV标志物和preS1相互关系研究

目的探讨荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA与HBV血清免疫学标志(HBVM)模式,preS1之间的相互关系及临床意义。方法采用实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测801例血清的HBVDNA,用ELISA方法对其免疫学标志,preS1同时进行检测。结果HBVDNA的总检出率为67·0%,preS1的总检出率为74·9%。其中,在模式HBsAg(+),HBeAg(+),HBcAb(+)中血清HBVDNA含量明显高于HBsAg(+),HBeAb(+),HcAb(+)及HBsAg(+),HBcAb(+)组。在HBsAg(-)模式中HBVDNA亦有检出。在HBsAg(+),HBeAb(+),HcAb(+)组,HBVDNA的检出率为55·8%,而preS1的检出率为69·8%,两者有显著差异(P<0·01),其余HBVM模式,无显著差异(P>0·05)。结论HBVM和preS1提供了HBV感染的间接证据,荧光定量PCR法检测HBVDNA准确灵敏,是HBV感染及复制的直接证据,HBVM,preS1和HBVDNA的检测各有其独特的临床检测意义,在乙型肝炎的诊断治疗中均具有重要的临床指导价值。

酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制。方法以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用。将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序。结果成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性。结论利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础。

HBVPreS1抗原和HBV DNA的监测及临床评价

目的研究HBV前S1抗原检测的临床价值,即HBVPreS1抗原与具有病毒活动性复制意义的指标HBeAg和HBV-DNA之间的相关性其与肝功能指标ALT之间的关系。方法HBV前S1抗原和血清标志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb-IgG、HBcAb-IgM)采用ELISA法检测;肝功能(ALT)用酶学速率法检测;HBV DNA用荧光定量PCR法检测。结果①HBeAg阳性组其HBV PreS1抗原检出率高。②HBV PreS1抗原与具有病毒活动性复制意义的指标HBV-DNA有良好的一致性。③慢性活动性肝炎肝功能指标ALT>40 u/l组其HBV PreS1抗原检出率高。结论HBVPreS1抗原和HBV DNA的检测结果可以较好地反映HBV的复制及慢性肝炎的活动情况。PreS1抗原可以作为HBeAg和HBV-DNA的补充,也可作为判断慢性乙型肝炎患者病情活动性的一项指标。对乙肝的诊断、疗效判断与观察具有较高的价值。

HBV感染者血清表面抗原大蛋白,DANE颗粒,HBV-DNA与PreS1蛋白检测分析

目的 检测HBV感染者血清中乙肝表面抗原大蛋白（LHBS）,DANE颗粒,HBV-DNA和PreS1蛋白,探讨LHBS在临床诊治中的价值.方法 对1 042例HBV感染者采用酶联免疫吸附试验检测乙肝病毒HBeAg,LHBS,DANE颗粒和PreS1蛋白,并采用定性PCR检测HBV-DNA.结果 245例HBeAg（＋）的HBV感染者中,LHBS阳性率（96.33%）,DANE颗粒阳性率（90.20%）,分别与HBV-DNA阳性率（92.65%）比较,差异无统计学显著性意义（P＞0.05）,三者均明显高于PreS1阳性率（66.53%）,差异均有统计学显著性意义（P＜0.01）;797例HBeAg（-）的HBV感染者中,LHBS阳性率（78.17%）高于DANE颗粒阳性率（56.46%）,HBV-DNA阳性率（33.12%）和PreS1阳性率（17.44%）,依次比较差异均有统计学显著性意义（P＜0.01）.结论 LHBS是判断HBV感染者体内病毒复制程度的可靠指标,在HBeAg（-）的HBV感染者中,LHBS有指导治疗、预后判断的作用;DANE颗粒亦是判断病毒复制程度的可靠的新指标.LHBS和DANE可用于暂无条件开展PCR实验的的基层医疗单位,代替HBV-DNA检测.

血清PreS1、PreS2抗原在乙肝诊断中的价值

乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染性疾病．可引起肝硬化及肝癌。我国是乙肝大国．平均感染率高达10％以上．以往通常用乙型肝炎病毒标志物（HBV—M1及HBV—DNA的检测结果来明确诊断及指导治疗。近年来研究发现Ⅲ．HBV外膜蛋白抗原PreS1与PreS2的抗原性较强．对乙肝诊断具有一定的临床意义。本组对389例不同HBV标志物模式的标本进行了PreS1及PreS2抗原检测．并将结果进行比较和分析，旨在评价血清PreS1、PreS2抗原在乙肝临床诊断中的价值。

乙型肝炎患者PreS1Ag、HBV-DNA以及肝功能联合检测分析

目的:通过对乙肝患者进行"乙肝两对半"、前S1抗原(PreS1Ag)、HBV-DNA以及肝功能的联合检测,了解乙肝患者各项指标的相关性以及HBV-DNA和PreS1Ag阳性患者及乙肝五项不同阳性组别与肝功能的损害关系。方法:"乙肝两对半"、前S1抗原采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测,HBV-DNA采用荧光定量PCR法检测,肝功能采用日本奥林巴斯AL2700全自动生化分析仪检测。结果:215例乙肝五项不同阳性组别的患者中共有189例前S1抗原阳性,阳性率为87.91%,其中有109例HBeAg阳性患者前S1抗原阳性为102例,HBV-DNA阳性为98例,符合率为96.08%(98/102),差异无统计学意义(P>0.05)。109例"大三阳"患者谷丙转氨酶(ALT)升高者占68.81%,63例"小三阳"患者ALT升者占38.10%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PreS1Ag不仅能够反映乙肝病毒的复制情况,而且更是病毒感染性的指标,与HBeAg、HBV-DNA、ALT呈正相关,这对乙肝患者的诊治和疗效具有很好的临床应用价值。

ASGPR与HBV preS1蛋白之间相互作用的验证

目的验证去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)与乙肝病毒前S1蛋白(HBV preS1蛋白)之间的相互作用,确认ASGPR作为乙肝病毒肝细胞膜受体在介导乙肝病毒感染的分子机制中的作用。方法分别用哺乳动物双杂交及体外免疫共沉淀技术验证ASGPR与HBV preS1蛋白之间的相互作用,操作方法参照试剂盒说明书进行。结果哺乳动物双杂交实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在细胞环境中具有相互作用;免疫共沉淀实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在非细胞环境中具有相互作用。结论 ASGPR可能是介导HBV入侵的肝细胞膜受体之一。

HBsAg阴性preS1Ag阳性的HBV携带者血清学标志物及其HBVDNA动态观察

目的探讨HBsAg(-)/HBeAg(+)/HBcAb(+)/preS1Ag(+)少见血清学模式形成的原因,了解该少见模式乙肝病毒携带者体内血清学标志物及其HBVDNA变化情况。方法采用ELISA、电化学发光免疫分析法(ECLIA)、巢式PCR和实时荧光定量PCR,对该少见模式乙肝病毒携带者HBV血清学标志物和HBVDNA进行检测,每隔3个月复查一次,持续15个月。结果在研究的时间内,国产ELISA试剂盒检测结果均为HBsAg(-)/HBeAg(+)/HBcAb(+)/preS1Ag(+);电化学发光免疫分析法检测HBsAg均为阳性,并随时间延续HBsAg水平逐渐下降;巢式PCR与实时荧光定量PCR检测HBVDNA为阳性,病毒载量上下波动。结论该乙肝病毒携带者血清学少见模式HBsAg为假阴性,动态观察HBsAg与HBVDNA水平,了解HBV复制情况,可为临床诊治提供可靠的依据。