长双歧杆菌NCC2705葡萄糖与乳糖代谢的比较蛋白质组学

【目的】以本实验室前期构建的长双歧杆菌NCC2705菌株蛋白质参考图谱为基础,研究长双歧杆菌发酵乳糖和葡萄糖的比较蛋白质组学。【方法】采用ImageMaster 2D Elite Platnum Version5.0比较分析3倍以上蛋白差异点;利用MALDI-TOF进行差异蛋白鉴定,每个蛋白质点的肽指纹图谱在长双歧杆菌NCC2705菌株的蛋白质数据库用Mascot进行检索;采用Pro-Q磷酸化试剂进行磷酸化蛋白的染色。【结果】鉴定到31个蛋白表达发生显著变化,在乳糖发酵中14个蛋白上调17个蛋白下调。这些蛋白为亲水性酸性蛋白,它们基因的CAI值均在0.5以上,主要包括糖代谢相关蛋白、应激蛋白、转录和翻译相关蛋白,还有一些未知功能的蛋白。此外,有两个蛋白:转醛缩酶(BL0715,transaldolase,tal)L3蛋白点和丙酮酸激酶(BL0988,pyruvate kinase,pyk)G9蛋白点发生了磷酸化作用。【结论】长双歧杆菌NCC2705在乳糖中生长快于葡萄糖,它们的降解途径是相同的;转醛缩酶和丙酮酸激酶发生了翻译后修饰作用,推测转醛缩酶在43T和47S发生了磷酸化,而丙酮酸激酶在65S发生了磷酸化。

全氟十二烷酸(PFDoA)慢性暴露干扰大鼠肝脏磷酸化蛋白质水平

全氟烷基类化合物(PFASs)是一类新型持久性有机污染物,因其独特的理化性质被广泛应用于工业和商业领域,对生物体具有一定的毒性作用。为探究全氟十二烷酸(PFDo A)致肝脏毒性作用机制,选择雄性大鼠为受试生物,采用2-DE蛋白质组学技术与Pro Q Diamond dye磷酸化蛋白染色结合的方法初步研究了不同剂量PFDo A暴露110 d后大鼠肝脏蛋白磷酸化水平的变化。结果表明,30个磷酸化蛋白表达水平在PFDo A处理后发生显著变化,其中,经过MALDI-TOF/TOF质谱分析,成功鉴定18个蛋白点。经过生物信息学分析,发现这些蛋白主要涉及糖脂代谢、氨基酸代谢、应激防御及电子传递等途径。以上结果有助于进一步从翻译后修饰水平了解PFDo A的肝脏毒性作用。

富含多糖的芜菁根皮中磷酸化蛋白的Pro-Q Diamond/SYPRO荧光染料分析技术和质谱鉴定方法

介绍了利用Pro-Q Diamond/SYPRO荧光染料分析磷酸化蛋白在芜菁根皮中的表达。比较了酚法、SDS法、Tris-HCl法、TCA-丙酮法、裂解液直接裂解法和改良的酚2h沉淀法所提取芜菁根皮中总蛋白的浓度和纯度。最后用改良酚法提取了芜菁的总蛋白,双相电泳分离后,用Pro-Q Diamond/SYPRO荧光染料染色对磷酸化蛋白进行染色分析,并对磷酸化蛋白点做了质谱鉴定。

三斑海马骨骼染色方法改进及骨骼结构特点研究

【目的】明确三斑海马(Hippocampus trimaculatus)的骨骼特点,为三斑海马的种类鉴定提供技术支持,同时为海马的基础生物学积累数据。【方法】在透明化骨骼染色法的基础上,进一步改进三斑海马骨骼染色方法,并对三斑海马的骨骼特点进行细节性描述。【结果】相对于传统的透明化骨骼染色法,改进后的透明化骨骼染色法在再脱色与透明环节中,通过添加少量H2O2有效去除组织中残留的染色剂,同时添加少量2%KOH促使组织更加透明,且在装瓶步骤中正向直立放置三斑海马骨骼标本。三斑海马的背鳍鳍条数为19~21条,胸鳍鳍条数为18~19条;其头部有独特结构:有多个凸出的棘,颌骨部分构成管状结构,鳃盖后缘无鳃孔,鳃孔开口在鳃盖后缘正上方头顶位置;三斑海马自头部以下至尾端体表均由菱形骨片构成的骨环包被,胸腹部共有12节骨环,除第11和12节骨环外,每节骨环均由7片不规则的菱形骨骼构成,骨环内部及骨环间存在滑道结构,为运动和摄食提供立体空间;尾部共有40~41节骨环,每节骨环均由4片菱形骨片构成,骨环向尾末端逐渐缩小,骨环间也存在滑道结构,具攀附功能。【结论】改进后的透明化骨骼染色法更适合于三斑海马骨骼染色,操作便捷,骨骼标本质量高。三斑海马具有独特的头部骨骼结构与摄食方式,自头部以下全身包被骨骼,外骨骼主要由菱形骨片构成,但构成不同部位骨环的菱形骨片数量不同;骨环内部及骨环间存在滑道结构,为三斑海马的运动和摄食提供立体空间,因此可通过胸腹部膨胀围度判断三斑海马的营养状况及雌性三斑海马的性腺发育情况。

一种磷酸化蛋白质组定性定量分析方法的考察

目的对用于磷酸化蛋白质的相对定量分析的一种基于双向差示凝胶电泳(2-DDIGE)技术和Pro-Q Diamond荧光染色的方法进行考察。方法采用DIGE技术,从Pro-Q Diamond染色后对Cy2、Cy5荧光强度的影响、Pro-Q Diamond染色过程中采用的试剂对CyDye标记的蛋白质的影响、去离子水对DIGE扫描结果的影响、CyDye染料扫描的稳定性影响等方面,考察了该方法的有效性和特异性。结果在Pro-Q Diamond染色前对DIGE凝胶进行处理的过程中,有多种因素影响荧光强度变化,以致在进行Pro-Q Diamond染色后,凝胶点的荧光强度变化无法区分是染色造成的灰度值变化还是CyDye染料自身的变化,从而使通过荧光强度变化来定量检测磷酸化蛋白质变得困难。结论不宜采用对同一DIGE凝胶进行Pro-Q Diamond再染色检测磷酸化蛋白质的方法进行比较蛋白质组学的定量分析,为能同时展示出胶上的磷酸化蛋白质和总蛋白质,可通过DIGE实验与Pro-Q Diamond分开运行,再通过DIGE扫描图谱与Pro-Q Diamond染色图谱进行匹配的方法进行改进。