微小隐孢子虫表面抗原CP23基因的克隆及表达

目的构建微小隐孢子虫表面抗原CP23基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法用微小隐孢子虫卵囊感染免疫抑制BALB/c小鼠,用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化微小隐孢子虫卵囊,用酚-氯仿抽提法提取微小隐孢子虫基因组DNA,PCR扩增CP23基因片段,然后克隆至TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将CP23基因片段用限制性内切酶切下克隆至pET-30a(+)载体,构建pET-30a-23质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果扩增出约340bp的微小隐孢子虫CP23基因片段并成功构建pET-30a-23质粒,表达出分子质量单位为27ku的融合蛋白,Western blot显示该蛋白能被抗微小隐孢子虫血清识别。结论成功构建pET-30a-23质粒,表达产物具有免疫反应性,为微小隐孢子虫的免疫学诊断及疫苗研制打下了基础。

保定地区奶牛源微小隐孢子虫子孢子表面抗原Cp23免疫特性的研究

为了解河北省保定地区奶牛源微小隐孢子虫子孢子表面抗原Cp23的免疫特性,将重组质粒p ET28-Cp23表达产物纯化后免疫4周龄BALB/c小鼠,进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果显示,试验组的CD4~＋/CD8~＋T淋巴细胞比值和Ig G水平增加明显,IL-12及IFN-γ的质量浓度亦都增高,与对照组比较均有统计学意义（P〈0.01）。结果表明,用重组蛋白Cp23免疫小鼠后可产生高水平的体液免疫和细胞免疫。本研究为保定地区隐孢子虫病的预防提供了材料。

构建检测隐孢子虫特异性抗体的多重微粒子免疫检测法

目的建立一种检测微小隐孢子虫特异性抗体的微粒子免疫检测法(MIA)。方法以纯化的重组蛋白CP23、SA35和SA40为检测抗原,以牛血清白蛋白(BSA)为内参,偶联微粒子,并进行蛋白偶联效率验证。比较单一MIA法和多重MIA法的一致性,以及多重MIA法检测的板内和板间差异。结果纯化蛋白和BSA成功偶联到相应的微粒子上,建立了多重MIA法检测血清隐孢子虫抗体的最佳检测条件,且证实多重检测并不降低检测的敏感性和特异性。结论多重MIA法可以快速检测隐孢子虫感染后人体产生的多种特异性抗体,敏感性、特异性均较高,可成为人群大规模血清流行病学调查的有力工具之一。