膀胱癌中CAIX和β-catenin的表达及临床意义

目的探讨碳酸酐酶IX蛋白(CAIX)及β-连环蛋白(β-catenin)在膀胱癌中的表达及临床病理意义。方法对65例膀胱癌组织和31例癌旁尿路上皮免疫组化EnVision法检测CAIX及β-catenin蛋白表达,分析两者表达与膀胱癌临床病理特征的关系及两者表达的相关性。结果膀胱癌组织中CAIX及β-catenin蛋白表达明显高于癌旁尿路上皮(P<0.05)。CAIX蛋白表达与膀胱癌组织学分级、临床分期有关(P<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤最大直径、单发/多发无关(P>0.05)。β-catenin蛋白表达与膀胱癌患者组织学分级有关(P<0.05),与患者年龄、性别、临床分期、肿瘤最大直径以及肿瘤单发/多发无关(P>0.05)。膀胱癌组织中CAIX及β-catenin蛋白表达呈正相关(P<0.05)。结论①CAIX、β-catenin在膀胱癌组织中表达上调,可能参与膀胱癌的发生;②CAIX和β-catenin异常表达与膀胱癌组织学分级、临床分期有关,提示可能参与膀胱癌恶性发展;③膀胱癌中CAIX、β-catenin表达呈正相关。

犬传染性肝炎病毒IX基因的克隆及原核表达

通过对犬传染性肝炎病毒(CAV-I)基因组的提取,PCR扩增获得了大小为1109bpCAV-I病毒结构IX基因片段,成功地将IX基因克隆至载体pMD-18T中,构建了pIX原核表达载体pGEX-4T1-IX,将重组质粒pGEX-4T1-IX转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,并实现了IX基因在该菌中的高效表达。对表达产物进行了Westernblot检测,分析结果表明表达蛋白能与抗CAV-I阳性血清发生特异性的抗原-抗体反应,为CAV-I的血清学诊断和免疫监测提供大量优质的抗原奠定了基础。

牙龈卟啉单胞菌第Ⅸ型分泌系统结构与功能研究进展

牙龈卟啉单胞菌第Ⅸ型分泌系统(type Ⅸ secretion system,T9SS)是一种最近被发现的新型蛋白分泌系统,它广泛分布于拟杆菌中。T9SS结构复杂、功能强大,目前已经得到验证的T9SS组分20余种,并且仅在牙龈卟啉单胞菌中即能分泌30余种毒力因子,对牙龈卟啉单胞菌的致病性意义重大。T9SS是一个横跨细胞内膜、细胞周质、细胞外膜的大型蛋白复合体,通过各组分之间结构和功能上的联系,组成了一个包括动力提供、能量转导、内外膜易位、外膜修饰及调节系统的精密功能复合体,对货物蛋白进行识别、转运、剪切、修饰,并将细菌胞内货物蛋白转运至细胞表面。近年来,随着X线衍射及原位冷冻电镜技术的发展,对T9SS的探究也从单一组分的功能研究发展至多蛋白复合体原位结构研究,但是目前对蛋白结构解析仍存在分辨率不高、无法捕捉动态功能结构等问题,未来研究方向应该更集中于探索T9SS如何与货物蛋白相互作用并发挥功能。本文对牙龈卟啉单胞菌T9SS在X线衍射及冷冻电镜结构解析上的研究进展做一综述,以便深入理解T9SS的转运机制。

TMPyP4-PDT对人卵巢癌A2780细胞的杀伤作用及其对MCM2和CA-Ⅸ mRNA表达的影响

目的:观察四-(N-甲基-4-吡啶基)卟啉(TMPyP4)对人卵巢癌A2780细胞的光动力学杀伤作用及其对微型染色体维持蛋白2(MCM2)和碳酸酐酶Ⅸ(CA-Ⅸ)mRNA表达水平的影响,阐明TMPyP4-PDT(光动力疗法)对人卵巢癌A2780细胞的杀伤作用机制。方法:体外培养人卵巢癌A2780细胞株,按不同处理因素分为空白对照组、单纯TMPyP4组、单纯PDT组和TMPyP4-PDT组。采用CCK-8法检测TMPyP4-PDT对A2780细胞株的增殖抑制作用。流式细胞术测定不同浓度TMPyP4对A2780细胞株凋亡的影响。光镜下观察各组细胞HE染色的形态学变化。实时荧光定量PCR法检测MCM2和CA-IX mRNA表达水平的变化。结果:与空白对照组比较,单纯TMPyP4组随着药物浓度的增加,细胞的增殖抑制率逐渐增加(P<0.05);单纯PDT组细胞增殖抑制率增加不明显(P>0.05);TMPyP4-PDT组细胞增殖抑制率随着药物浓度及激光能量密度的增加而增加(P<0.05)。流式细胞术检测,TMPyP4-PDT可诱导A2780细胞凋亡,在激光能量密度为4J.cm-2的条件下,3、6、15、30和60μmol.L-1 TMPyP4作用4h,A2780细胞凋亡率分别为(9.46±0.04)%、(17.7±0.3)%、(25.4±0.2)%、(30.2±0.2)%和(66.3±0.3)%。光镜下可观察到空白对照组及单纯PDT组贴壁细胞多,无核固缩及核碎裂样改变;单纯TMPyP4组及TMPyP4-PDT组贴壁细胞减少,出现核固缩、空泡及部分胞浆溶解样改变。实时荧光定量PCR法检测,在激光能量密度为4J.cm-2的条件下,3、6、15、30和60μmol.L-1TMPyP4作用4h,MCM2和CA-IX mRNA表达水平明显降低,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:TMPyP4-PDT对人卵巢癌A2780细胞有明显杀伤作用,其机制可能与负性调节MCM2和CA-Ⅸ的表达有关。

组织工程化骨修复材料的弹性模量测定及其临床意义

目的对组织工程化骨形成蛋白-脱钙骨基质颗粒-骨水泥复合材料进行弹性模量测定并探讨其临床意义。方法提取牛骨形成蛋白(bBMP)并进行成骨诱导活性测定,制备人的异体脱钙骨基质颗粒(DBM),将bBMP与DBM以1:25的质量比复合后,再与骨水泥(BC)按0:10,4:6,5:5,6:4和7.5:2.5的质量比进行复合,对所得的骨形成蛋白-脱钙骨基质颗粒-骨水泥复合材料进行弹性模量测定,并与正常人成年男性的股骨、股骨下端松质骨的弹性模量相比较。结果对测定结果进行统计学分析,含bBMP-DBM复合物75%的复合材料的弹性模量与正常成年男性股骨下端松质骨的弹性模量差异无显著性意义,P<0.01,其余各组两两比较均差异有显著性意义,P>0.01。结论含bBMP-DBM复合物75%的复合材料与成年男性股骨下端松质骨的弹性模量相接近,用其修复靠近关节面附近骨缺损可有效的防止关节的退行性变。

血管性血友病因子和血小板表面受体突变的数据库构建及数据分析

背景:血管性血友病因子和血小板表面受体之间的相互作用在血小板黏附、传播、聚集等血栓形成过程中起到关键作用。目前关于血管性血友病因子突变信息的数据库并不完善且血小板表面受体相关的数据库仍未构建。目的:致力于构建血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα相关突变的数据库,以利于相关领域的研究人员快速查找到该分子对的重要突变信息。方法:以数据库Uniprot、VWFdb及文献报道的突变信息为数据源,采用MySQL和Apache为后台数据库和服务器,运用PHP语言开发血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα突变数据库。结果与结论:收集了341条血管性血友病因子,13条血小板糖蛋白Ibα的野生或者突变序列数据,并人工构建A1结构域的虚拟突变3 920条,建立了包括背景介绍、相关病理图册和资料下载等登录页面,初步实现了数据检索、突变位点分析以及虚拟突变位点信息等相关功能。该数据库较全面搜集及分析血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα的数据信息,有利于研究人员对血管性血友病因子和血小板糖蛋白Ibα相关信息的查询,有助于新型抗血栓药物的研发,进一步提高临床诊断和治疗水平。

晚期胃肠道肿瘤正虚程度与外周血肿瘤缺氧相关蛋白关系

目的探讨晚期胃肠道肿瘤正虚程度与外周血肿瘤缺氧相关蛋白之间的关系。方法普陀医院肿瘤科2012年4月1日到2013年4月10日IV期胃肠道肿瘤患者46例,以卡氏(Karnofsky Performance Status,KPS)评分、中医症候(气短、纳差、爪甲不荣)作为评价患者正虚指标,并根据正虚指标分别分组,采用酶联免疫吸附法检测患者血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX,CAIX)水平。结果经成组t检验,晚期胃肠道肿瘤患者KPS≤60分组与KPS>60分组比较,前者VEGF、OPN、CAIX水平分别是后者的1.75倍(P<0.05)、1.10倍(P>0.05)、1.68倍(P<0.05)。晚期胃肠道肿瘤具有气短、纳差、爪甲不荣症状患者外周血VEGF、OPN、CAIX水平均明显高于无上述症状患者(爪甲不荣组CAIX除外),其中以VEGF指标均有统计学意义(P<0.05)。结论晚期胃肠道肿瘤正虚程度与外周血缺氧相关蛋白VEGF、OPN、CAIX相关。

凝血因子Ⅸ纳米膜过滤条件的优化

目的提高纳米膜单位面积内凝血因子Ⅸ(FⅨ)的过滤量。方法采用正交试验设计方法,检验不同蛋白质浓度0.5、0.6、0.7 mg/m L FⅨ;温度4.0、15.0、25.0℃;预过滤膜类型:分别为Millipore(0.1μm、10 cm2),PALL(0.1μm、10 cm2),3M(0.1μm、10 cm2)对FⅨ过滤量的影响,记录2 h FⅨ过滤总量,分析比较过滤优化条件。结果0.7 mg/m L的FⅨ,25℃时,能使20 nm纳米膜的过滤载量由7.6㎏/m2提高至10.2㎏/m2。结论通过优化FⅨ浓度、过滤温度及滤膜类型等条件,可明显提高纳米膜对FⅨ的过滤载量,从而降低生产过程中纳滤膜过滤的成本。

一种经miniSOG标记的人腺病毒的制备

为了探索腺病毒感染细胞后病毒核心在胞内运输的过程,本研究构建了一株经miniSOG标记IX蛋白的人腺病毒。首先,我们通过重叠延伸PCR的方法合成了miniSOG基因,将其克隆至pcDNA3表达载体后转染293细胞,荧光显微镜下可观察到miniSOG蛋白的表达,经固定,封闭,DAB-H2O2染色,OsO4固定染色后,可见表达miniSOG蛋白的细胞呈深褐色。之后将miniSOG构建至腺病毒穿梭载体pShuttle的IX基因3’端,并通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内同源重组获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXSOG。pAd5-IXSOG质粒经PacI酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组腺病毒HAdV-5-IXSOG。经过8轮扩增,超速离心纯化后获得2.0ml浓度为6.0×1011vp/mL的重组腺病毒,电子显微镜下可见完整病毒颗粒。本研究经反向遗传学技术对腺病毒载体进行改造,成功制备了经miniSOG标记的重组腺病毒HAdV-5-IXSOG,该病毒可用于腺病毒感染细胞的实时追踪。

建立基于miniSOG标签的光镜-电镜关联方法观察腺病毒Ⅸ蛋白的亚细胞定位

目的 建立光镜-电镜关联方法观察腺病毒蛋白Ⅸ的细胞内定位.方法 miniSOG是新发现的能够被荧光显微镜和电子显微镜解析的蛋白标签.通过PCR方法克隆腺病毒结构蛋白Ⅸ与miniSOG的融合基因ⅨSOG,将其构建至真核表达载体,转染细胞;通过荧光显微镜确定ⅨSOG蛋白表达的细胞,之后对转染细胞进行原位固定、光氧化、制备超薄切片,用电镜观察细胞内ⅨSOG融合蛋白的表达及分布情况.结果 在蓝光激发下,miniSOG能够发射绿色荧光.定位选择光氧化形成嗜锇颗粒的ⅨSOG表达细胞进行电镜观察,结果显示Ⅸ蛋白在细胞核内多个区域形成点状聚集或包涵体.结论 建立了依赖miniSOG标签的的光镜-电镜关联方法,该方法可用于病毒蛋白细胞内定位研究.

选择性碳酸酐酶Ⅸ抑制剂的研究进展

碳酸酐酶(carbonic anhydrases,CAs)是一类广泛分布于生物体内的金属酶,催化生物体内二氧化碳和碳酸氢根离子的相互转化。CAK在正常组织中几乎不表达而在许多实体瘤中过度表达,促进肿瘤细胞的存活及转移性扩散,因此被确定为肿瘤相关蛋白。自1992年CAK的结构被确定以来,CAK抑制剂发展为药物化学领域的研究热点之一,四大类经典的碳酸酐酶抑制剂(CAIs)以及一些新型选择性CAIs不断被发现,部分化合物进人了临床研究阶段。本文对近5年CAK选择性抑制剂的研究进展进行综述。

GFP标记Ⅸ蛋白的重组腺病毒的构建与鉴定

目的 为了更加直观地观察腺病毒（Adenovirus,Ad）与细胞之间的相互作用,本研究拟构建一株经绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）标记（pⅨ）蛋白的5型重组腺病毒（Ad5-IXGFP）.方法 我们将GFP基因构建至腺病毒穿梭质粒pShuttle中Ⅸ基因3＇端,通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内的同源重组,获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXGFP.将pAd5-IXGFP质粒经Pac Ⅰ酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组腺病毒Ad5-IXGFP.结果 经扩增和超速离心纯化后可获得浓度为6.9＆#215;1011 vp/ml的重组腺病毒.该病毒于4℃与HEp-2细胞孵育后,重组病毒吸附于HEp-2细胞表面,用荧光显微镜观察,可见绿色荧光.结论 利用反向遗传学技术对重组腺病毒外壳蛋白pⅨ进行修饰,成功制备的经GFP标记的重组腺病毒可用于实时动态追踪腺病毒颗粒感染细胞的过程.

桩蛋白与碳酸酐酶Ⅸ在十二指肠乳头癌组织中的表达及意义

目的探讨十二指肠乳头癌组织中桩蛋白与碳酸酐酶Ⅸ（CAIX）的表达及意义。方法应用免疫组织化学方法检测87例十二指肠乳头癌组织中桩蛋白与CAIX的表达情况。结果桩蛋白表达阳性率为74．7％（65／87），明显高于癌旁组织[41．0％（16／39）]和十二指肠乳头炎组织[41．3％（19／46），差异有统计学意义（x2=19．869，P〈0．05）。CAIX表达阳性率为71．3％（62／87），明显高于癌旁组织[33．3％（13／39）]和十二指肠乳头炎组织[30．4％（14／46），差异有统计学意义（X2=26．936，P〈0．05）。随着癌组织恶性程度以及远隔转移程度的增加，桩蛋白与CAIX的表达随之增强。结论桩蛋白与CAIX是对十二指肠乳头癌进行早期诊断以及判断预后的重要指标。