表达非洲猪瘟病毒p72蛋白重组猪痘病毒的构建及鉴定

【目的】旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,为探索猪痘病毒(SPV)作为非洲猪瘟新型活疫苗载体的可行性。【方法】本研究优化合成非洲猪瘟病毒B646L基因,克隆至重组猪痘病毒通用转移载体pUSG11/P28,构建重组转移质粒pUSG11/P28-B646L,经脂质体介导转染预先感染猪痘病毒的PK15细胞,出现病变后通过绿色荧光标记筛选和纯化重组病毒。拯救的重组病毒经PCR和基因测序鉴定后,通过Western blotting和间接免疫荧光试验检测p72蛋白的表达情况,并测定重组病毒的增殖特性和遗传稳定性。【结果】重组转移质粒pUSG11/P28-B646L在PK15细胞内和SPV成功进行了同源重组,纯化得到的重组病毒含有B646L基因,且基因序列正确。Western blotting和间接免疫荧光试验结果表明,重组病毒rSPV-B646L在PK15细胞中能表达非洲猪瘟病毒p72蛋白,表达的蛋白大小正确,且能与p72单克隆抗体发生特异性反应。一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性没有明显差异。重组病毒在PK15细胞上连续传15代后,插入的外源基因没有发生突变或缺失。【结论】研究以SPV为载体,成功构建了正确表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,重组病毒在PK15细胞中有良好的遗传稳定性,B646L基因的插入没有影响重组病毒在PK15细胞上的增殖能力,表达的p72蛋白具有反应原性。研究成果为非洲猪瘟多基因重组猪痘病毒载体疫苗的研发提供依据。

基于p72蛋白的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸研制

为了研制灵敏、准确、特异及稳定的非洲猪瘟抗体快速检测试纸产品,以非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白为检测抗原,以金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)为拦截线,对比重组蛋白p72的不同状态对试纸检测性能影响,优化标记条件、喷膜浓度、样品垫缓冲体系及成分、显色时间等因素,确定ASFV抗体检测试纸产品化的具体参数,并对试纸的特异性、均一性、准确性及稳定性进行鉴定。结果显示,试纸的检测敏感性为1∶51200,优于商业化ASFV检测试剂盒,与其他猪源病毒阳性血清无交叉反应,变异系数小于10%,在临床样本检测中未见假阴性及假阳性结果,具有良好的敏感性、特异性、均一性及准确性;经加速稳定试验验证,可以室温保存1 a以上;与进口商品化试剂盒的总符合率为91.6%。综上,成功研制了ASFV抗体检测试纸,且试纸的检测性能良好,可以用于ASFV抗体的快速筛查。

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

本研究将含有非洲猪瘟病毒p72全长基因序列的pCMV-p72重组质粒与B602L质粒共同转染HEK293F细胞,纯化获得重组p72-His蛋白,经SDS-PAGE和间接ELISA鉴定后,以该纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,进行融合、筛选获得4株单克隆抗体。经亚型鉴定,2B2-1、34C10和22D3均为IgG1/κ型,32H5为IgG2b/κ型,4株单克隆抗体的腹水效价均高于6.4×104。免疫荧光检测结果显示4株单克隆抗体均能够特异性识别ASFV p72蛋白,亲和力试验显示4株单克隆抗体的亲和力由高到低依次为22D3>32H5>2B2-1=34C10,表位竞争试验也揭示这4株单克隆抗体可识别不同的抗原结合位点,且2B2-1和32H5能组成识别抗原的抗体对,34C10单克隆抗体具有竞争效应。所获得的4株杂交瘤细胞株均能够稳定分泌抗体,且分泌的抗体特异性高,亲和力强,有助于进一步研发ASFV血清学诊断方法。

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究对ASFV p72蛋白进行原核表达并纯化,将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌p72蛋白的杂交瘤细胞株3F8。以纯化的p72蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体(MAb)作为检测抗体,采用方正滴定法对反应条件优化后初步建立了检测ASFV的阻断ELISA方法。利用该方法检测133份ASFV阳性血清和73份ASFV阴性血清,通过ROC曲线分析确定临界值。结果显示,该方法的临界值为25.62%时,ROC的曲线面积最大,为0.9989,诊断敏感性和特异性分别为98.63%和98.5%。利用该方法检测ASFV、O型口蹄疫病毒(FMDV)、A型FMDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒阳性血清,结果显示,除ASFV阳性血清外,其他阳性血清均为阴性,表明特异性强;利用该方法和商品化试剂盒对2倍倍比稀释(1∶4~1∶2048)的两种ASFV灭活阳性血清(P1、P2)检测,结果显示该方法检测结果与商品化试剂盒基本一致,敏感性高。利用该方法对3份灭活的ASFV阳性血清进行批内和批间的重复性检测,结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性好。利用该检测方法和商品化试剂盒同时检测216份临床血清样品,两种方法检测结果符合率为99.07%。本研究所建立的阻断ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于ASFV抗体的检测,为非洲猪瘟流行病学调查及弱毒株疫苗抗体评价提供技术支撑。

非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)B646L基因编码的结构蛋白p72是高度保守的抗原,常用作ASFV检测方法的建立。论文将截短的B646L基因连接在pET28b载体,重组质粒命名为pET28b-B646L。将重组质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化p72蛋白并免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。Western blot和IFA验证结果表明,成功获得1株IgG1亚型的ASFV p72特异性单克隆抗体,可为建立ASFV血清学检测方法提供参考。

非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及单克隆抗体制备

【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合并制备单克隆抗体,通过间接ELISA法和亚克隆筛选出分泌抗体的阳性杂交瘤细胞;通过小鼠抗体类型检测试剂盒检测抗体类型;通过体内诱生法制备抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体腹水,使用饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,通过间接ELISA法、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting检测单克隆抗体效价和特异性。【结果】ASFV p72重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,将纯化的p72蛋白制备单克隆抗体,获得4株分泌IgG1抗体的单克隆细胞株,分别命名为6F8、7C3、8H7和9G2。间接ELISA结果显示,6F8与8H7细胞株分泌的抗体效价均为1∶6400,7C3与9G2细胞株的抗体效价均为1∶12800,且4株细胞株分泌的抗体与p72蛋白反应结果均呈阳性,与猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)反应均呈阴性。4株单克隆细胞株分泌的抗体均能与p72真核蛋白发生特异性反应。【结论】本研究成功制备了4株能稳定分泌与ASFV p72蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究ASFV p72蛋白的功能以及非洲猪瘟的防控和诊断建立了基础。

非洲猪瘟病毒p72蛋白可溶性表达及鉴定

为获得可溶性的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白,将重组质粒pColdⅠ-p72分别与5种分子伴侣质粒进行融合表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;以重组蛋白His-p72免疫小鼠制备多克隆抗体,通过Western blot和间接免疫荧光方法鉴定多克隆抗体与真核表达蛋白的免疫反应性。结果显示,重组蛋白His-p72与伴侣蛋白pG-Tf2或pTf16共表达后,实现了可溶性表达。以可溶性His-p72蛋白免疫小鼠后,获得His-p72多克隆抗体,抗体效价达到1∶512000;Western blot和间接免疫荧光的试验结果显示多抗血清可特异性识别真核表达的p72蛋白。说明利用分子伴侣融合表达的ASFV p72可溶性蛋白具有较好的免疫反应性,为抗ASFV药物的研发提供了候选蛋白。

非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术,从含非洲猪瘟(ASFV)P72基因的克隆质粒BBBBPr4中扩增出1.94kb的P72基因。将P72基因和表达载体pET-30c(+)分别用限制性核酸内切酶FbaⅠ/XHoⅠ和BamHⅠ/XHoⅠ进行双酶切,然后在T4DNA连接酶作用下,将P72基因定向克隆至载体pET-30c(+)中相应位点上,并转化至宿主菌BL21(DE3)中,得到了重组菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)。经PCR鉴定,构建的重组菌株中含有P72基因。重组菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PAGE和Westernblot分析,结果表明衣壳蛋白P72基因可以在受体菌中高效表达,达到了菌体总蛋白的34%,表达产物的分子量约为78Ku,并能被ASFV抗体所识别。

非洲猪瘟病毒p72蛋白的真核表达及反应原性鉴定

将p72基因克隆到载体pFast Bac/NT-TOPO上,转化大肠埃希菌DH5α。将获得的重组载体pFastBac/NT-TOPO-p72,转化大肠埃希菌DH10Bac,获得重组杆状病毒质粒bacmid-p72。通过脂质体介导,将bacmid-p72转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染正常生长的sf9细胞,72h后收集细胞,超声破碎后取上清进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,重组蛋白大小约78ku,且重组蛋白可以与非洲猪瘟标准阳性血清反应。说明表达的重组蛋白为可溶性的,并具有良好的反应原性。

非洲猪瘟病毒p72蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析

为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。

非洲猪瘟病毒全长与截短p72蛋白的抗原性比较

比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定表达的蛋白,分析蛋白的抗原表位;用纯化的重组全长和截短p72蛋白分别免疫小鼠,比较其免疫原性;通过ELISA和Western blot,评价重组p72和p72s蛋白与ASFV阳性血清的免疫反应性。结果:重组p72和p72s蛋白均以包涵体形式表达,相对分子质量分别约为76和42 ku,与预期大小相符;表达蛋白的酶解肽段对p72和p72s蛋白推测氨基酸序列的覆盖度分别为89.3%和88.39%,两者分别包含27和17个抗原表位;用p72与p72s蛋白免疫小鼠3次后,血清特异性抗体效价分别为1∶200~1∶25600和1∶12800~1∶409600;基于重组p72与p72s蛋白的ELISA从108份猪血清中分别检出78份(72.2%)和85份(78.7%)阳性血清,两者的检测结果具有很好的一致性(kappa=0.826,P=0.016);经Western blot检测的10份ASFV抗体阳性血清中有7份与p72蛋白反应,全部与p72s蛋白反应。截短p72蛋白比全长p72蛋白的抗原性好,更适合用于ASFV抗体检测。

非洲猪瘟病毒抗体化学发光检测方法的建立与应用

【目的】建立一种特异性强、敏感度高、操作简捷、高通量的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体化学发光检测方法,用于早期监测ASFV的流行情况。【方法】本研究以羧基磁珠作为固相载体偶联ASFV重组p72蛋白,用适量的牛血清白蛋白(BSA)进行封闭,加入检测样品进行反应,以兔抗猪IgG-AP抗体作为酶标抗体,加入相应底物进行显色,优化各项反应条件,建立ASFV抗体化学发光检测方法,并对该方法的特异性、敏感度、重复性和检出率进行验证。【结果】建立的ASFV抗体化学发光检测方法蛋白与羧基磁珠偶联最适pH为7.0,最佳蛋白偶联浓度为5μg/mL,使用10%BSA溶液封闭效果最佳,反应磁珠终浓度为1.00 mg/mL,酶标二抗最佳工作稀释度为1∶40000。同时该方法反应时间为30 min,血清稀释度为1∶512,敏感度高于商品化ASFV抗体ELISA检测试剂盒,与猪瘟病毒、A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒gE、猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性标准血清均无交叉反应。重复性试验中,批内变异系数为4.41%~8.70%,批间变异系数为2.43%~8.07%,均<10%。通过检测120份血清样品并与商业化ASFV抗体ELISA检测试剂盒进行对比分析,商业化ELISA试剂盒检出率为96.7%,本研究建立的化学发光检测方法检出率为100%。【结论】本研究建立的ASFV抗体化学发光检测方法可用于ASFV感染后抗体水平检测,为后续试剂盒的开发提供参考。

基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72(p72s)蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5000;反应条件为:抗原于37℃孵育1 h后经4℃包被酶标板过夜、于37℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为:当待检血清的D_(450 nm)值≥0.365时,判定为阳性;当D_(450 nm)值<0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量(0.110~0.554 mg/mL);批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%(94/124)和32.26%(40/124)。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。

非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种非洲猪瘟病毒抗体阻断ELISA检测方法,以原核表达ASFV p72重组蛋白作为包被抗原,HRP标记的p72特异性单克隆抗体作为酶标抗体,建立了非洲猪瘟病毒抗体阻断酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。结果显示,该方法中血清以1∶10稀释,酶标单抗以1∶6000稀释,临界值为50.12%。该方法特异性强,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清无交叉反应。对强阳性血清的最低稀释度为1∶640,弱阳性血清的最低稀释度为1∶10,具有较高的敏感性;重复性好,批内和批间变异系数均小于5%。应用所建立的方法与商品化同类检测试剂盒对174份血清进行检测,ASFV抗体阳性符合率为100%,阴性符合率为96.75%,总符合率为97.28%。建立的阻断ELISA方法可用于非洲猪瘟病毒抗体检测。

表达非洲猪瘟病毒P72蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定

本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASFV-P72与pAd/CMV/V5-DEST腺病毒骨架载体进行重组,得到pAd-ASFV-P72重组质粒;重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,连续传代后获得重组腺病毒。结果表明,获得的Ad5-ASFV-P72重组腺病毒的滴度为2.53×10^9 IFU·m^L^-1;经免疫荧光方法及Western blot鉴定ASFV-P72蛋白在Vero细胞中成功表达,且能够与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。本研究成功获得能够表达ASFV P72蛋白的重组腺病毒Ad5-ASFV-P72,不仅为ASFV多基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了一定基础,还为ASFV相关血清学诊断方法的建立提供了安全有效的抗原。

非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准:当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。

非洲猪瘟病毒P72蛋白合成肽疫苗的构建及其免疫效力评估

【目的】构建非洲猪瘟病毒CAS19-01/2019株(GenBank登录号:MN172368.1)结构蛋白P72的合成肽疫苗,通过免疫小鼠评估合成肽疫苗的免疫效力。【方法】利用ProtParam、SOPMA等软件分析P72蛋白的理化性质与结构信息,通过ABCpred、SVMtrip、IEDB预测P72蛋白的T细胞与B细胞抗原表位,筛选出显著的表位多肽区域,合成多肽辅以弗氏佐剂腹腔注射免疫小鼠,检测免疫组小鼠产生的特异性抗体、T淋巴细胞亚群、脾脏淋巴细胞增殖、细胞因子白介素4(IL-4)、IL-2、γ干扰素(IFN-γ)、免疫球蛋白(IgG),从体液免疫与细胞免疫角度评估合成肽的免疫效力。【结果】综合分析得出P72蛋白是稳定性亲水蛋白,二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲分别占19.35%、5.42%、25.08%和50.15%。筛选出了P72蛋白的8个优势抗原表位,626-634、520-528、298-306、203-211位氨基酸处为T细胞抗原表位,587-606、232-251、110-129、39-58位氨基酸处为B细胞抗原表位。整合优势表位合成2个多肽P72-1与P72-2,首次免疫小鼠14 d时可检测到P72-1与P72-2的特异性抗体,首免后28 d达到最高值,其最高抗体效价分别为1∶25600与1∶12800;免疫后小鼠T淋巴细胞亚群CD4^(+)/CD8^(+)显著上升(P<0.05);脾脏淋巴细胞增殖试验结果显示,免疫组淋巴细胞数量均极显著升高(P<0.01);细胞因子IL-4、IL-2、IFN-γ含量均极显著增加(P<0.01)。【结论】本研究成功研制2种合成肽疫苗,在免疫效力上P72-2高于P72-1,二者都能产生高水平的特异性抗体,刺激脾脏淋巴细胞增殖,诱导产生细胞因子IL-4、IL-2、IFN-γ,本研究为非洲猪瘟合成肽疫苗研制奠定技术基础。

非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

本研究旨在用原核生物表达系统来表达非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L基因。获得其编码的p72重组蛋白,并针对纯化的p72重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV B646L全长基因连入pcold-Ⅰ表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导16 h后,利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。然后用纯化的p72重组蛋白为免疫原制备鼠源抗p72多克隆抗体,经过4次免疫后获得p72蛋白的多克隆抗体,随后采取血清来检测多克隆抗体。结果显示,利用p72蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步对ASFV B646L基因建立快速、特异的血清学诊断技术奠定基础。

非洲猪瘟病毒抗体ELISA检测方法的建立及初步评价

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测方法,分别用ASFV重组蛋白p30、p72、pA104R作为包被原建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,并进行初步评价。结果显示,ASFV重组蛋白p30、p72及pA104R分别按照25 ng/孔、50 ng/孔、50 ng/孔包被,血清样品均100倍稀释,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG均20000倍稀释作为酶标试剂条件最优。p30-ELISA、p72-ELISA、pA104R-ELISA临界值分别为0.502、0.567、0.550。样品检测S/P值≥临界值判为阳性,否则判为阴性。3种方法分别检测梯度稀释的ASFV阳性血清、ASFV(CD2v缺失)阳性血清,p72-ELISA灵敏度最高,为1∶64、1∶128;3种方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清各5份,ASFV阴性血清200份,结果均为阴性;3种方法批间、批内重复性变异系数均小于10%。说明建立的方法均可用于ASFV的血清学检测,为非洲猪瘟的防控提供了多样化的检测方法。

非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立

试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针,并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件,确立LNA-OSN-PCR标准曲线,并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法,对96份临床疑似患病样品进行检测,同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系,建立的LNA-OSN-PCR标准曲线,具有较好的线性(R2=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10^(-1)copies/μL,变异系数小于3%,并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较,检测灵敏度提高10~100倍,在对96份临床疑似患病核酸样品进行检测中,检出55份阳性,41份阴性,比常规的荧光定量PCR具有更高的阳性检出率。并且能获得典型的扩增曲线。试验结合一步法巢式PCR和锁核酸修饰,建立了ASFV一步法巢式锁核酸荧光定量PCR,为检测ASFV提供一种高灵敏度和高特异性且经济实惠的检测方法。