类风湿性关节炎血清补体水平相关因素分析

目的研究类风湿性关节炎的血清补体与患者性别、年龄、病程、类风湿因子、免疫球蛋白等免疫学指标及临床表现之间的关系。方法观察40例类风湿性关节炎患者的性别、年龄、病程、类风湿因子、免疫球蛋白、血清补体水平等免疫学指标及关节疼痛肿胀情况,并设10名健康人作正常对照组。结果RA组的补体C3、C4水平明显高于正常对照组(P<0.05),补体C3水平与关节压痛数呈直线正相关,补体C4水平与关节肿胀数呈直线正相关(P<0.05)。患者补体C3水平与ESR、-α1 AGP、PLT呈直线正相关(P<0.05)。患者补体C3水平与Hb呈直线负相关(P<0.05)。患者补体水平与病程、年龄无明显相关性。结论RA患者的补体与患者疾病的活动性密切相关,在一定程度上反映疾病的活动性,并能以此正确评价患者的疾病进展及分期。

潞党参多糖的抗补体活性分析

以山西上党地区著名道地药材潞党参为材料,分析其多糖成分的抗补体活性。首先,通过细胞溶血实验,分析潞党参多糖(Lu Codonopsis pilosula polysaccharides,LCPP)对补体经典途径和旁路途径的影响。结果表明,LCPP具有一定抗补体活性,CH_(50)值为2.061±0.127 mg/mL,AP_(50)值为6.725±0.895 mg/mL,并表现为明显的量效关系。随后,利用人HepG2细胞,通过实时定量PCR实验,分析LCPP对补体系统重要成分C3表达的影响,发现LCPP能够显著抑制肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的人HepG2细胞中C3的表达。以上结果提示,潞党参是一种潜在的补体抑制剂,在治疗补体过度激活所导致的自身免疫性疾病方面具有应用前景。

CDC法与ELISA法检测RSA患者封闭抗体的实验诊断价值

目的探讨和比较补体依赖的淋巴细胞毒试验(CDC)与酶联免疫吸附试验(ELISA)检测反复自然流产患者(RSA)封闭抗体(BA)的诊断意义。方法运用CDC法和ELISA法对110名行淋巴细胞主动免疫治疗的RSA患者作BA检测,用kappa系数评价2种检测方法的一致性,用McNemar检验比较两者抗体阳性率的差异。结果CDC法检出的补体依赖型BA阳性率为9.09%(10/110);ELISA法检出的IgG型HLA抗体阳性率为41.82%(46/110)(P<0.01),其中Ⅰ类抗体阳性、Ⅱ类抗体阳性、Ⅰ和Ⅱ类抗体均阳性者分别为6人、10人和30人。2种方法符合率为19.6%(9/46),kappa系数为0.202。ELISA法对HLA-Ⅰ和Ⅱ类抗体的检出率为32.7%(36/110)vs36.4%(40/110)(P>0.05)。结论 CDC法和ELISA法检测封闭抗体的结果一致性较弱,ELISA法灵敏度明显高于CDC法。CDC法和ELISA法检测的BA不完全相同,各有其诊断意义。

抗C3d单抗制备及免疫金层析法的建立

目的 研制抗C3d单抗 ,建立免疫金层析法检测血浆补体片段C3d ,判断补体活化情况。方法 用菊糖 C3b作抗原 ,免疫Balb/c小鼠 ,并制备杂交瘤 ,以羊抗C3包被酶标反应板并结合C3d为检测板 ,筛选分泌抗C3d单抗的杂交瘤。利用proteinG柱亲和层析提取抗C3d单抗IgG和C3d结合物 ,进行SDS PAGE电泳 ,鉴定单抗的特异性。将抗C3d单抗标以胶体金 ,制备免疫金层析测试条。通过在免疫金中加未标金的抗C3d单抗 (游离单抗 )来调整试纸条的灵敏度 ,并测定C3d。结果 SDS PAGE电泳图上 ,出现IgG的重链、轻链、及C3d 3个条带 ;金标记抗C3d单抗的试条 (Ⅰ )测C3d的灵敏度在 6～ 10ng/ml,当加入 0 .1μg/ml游离抗C3d单抗 (Ⅱ )后 ,灵敏度为 10～ 15ng/ml。利用两种试条灵敏度的不同 ,对轻、中重型肝炎检测 ,结果轻型肝炎患者在纸条Ⅰ上阳性率为 83 3% (2 5 / 30 ) ,纸条Ⅱ全为阴性 ,中重型肝炎者在纸条Ⅰ、Ⅱ的阳性率为 10 0 % (30 / 30 )。结论 用本试验建立的免疫金层析法测定肝炎患者血浆C3d水平 ,可判断补体活化程度 ,辅助乙型肝炎轻、重分型。

原发性肝癌患者红细胞CR1数量基因型及活性的检测

目的：探讨红细胞免疫功能与原发性肝癌发病之间的关系。方法：应用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法检测９４例肝癌、４９例肝硬化、４６例乙型肝炎患者及８０例正常人红细胞ＣＲ１数量基因型；同时利用ＥＬＩＳＡ方法检测红细胞ＣＲ１活性，并进行比较。结果：原发性肝癌、肝硬化患者红细胞ＣＲ１数量基因型与正常人比较相差显著（Ｐ＜０．０５），其红细胞免疫粘附（ＲＣＩＡ）活性明显低于正常人（Ｐ＜０．０１，＜０．０５）；乙肝、肝硬化、肝癌患者红细胞免疫复合物（ＩＣ）高于正常人（Ｐ＜０．０５）；不同疾病同基因型组间ＲＣＩ－Ａ活性相差不显著，而在于同种疾病不同基因型间ＲＣＩＡ活性相差显著（Ｐ＜０．０５）。

G蛋白偶联受体高阶聚化和信号转导中蛋白复合体的时空动态检测进展

传统观点认为,G蛋白偶联受体与G蛋白、调节蛋白、GRKs以及arrestins间的相互作用是连续的,其中涉及多个蛋白质之间快速的集合和解聚。而实际上,GPCRs和相关靶分子之间的作用是通过一系列细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的信号转导网络来实现的。近10年,随着一些新兴技术的出现,如FRET、BRET和BiFC,实时动态观测二个蛋白质间相互作用的研究成为热点。最近,一些技术结合的方法为从"时间、空间、动态、连续"检测更多蛋白质之间的相互作用的研究拉开新的帷幕。从横向来看,这些技术的结合可以用来研究细胞膜上3种甚至更多蛋白质的高阶寡聚化;从纵向来看,可以对细胞膜-细胞质-细胞核中所发生的信号转导网络的研究提供新的技术手段,多种技术结合所发挥作用是最近出现的几种技术所无法企及的,这对于疾病发病机制的研究及新的药物靶点的发现具有深远意义。因此,本文就一些技术的结合及其应用做一简要综述。

用PCA方法选择HBV DNA多聚酶TP区VH抗体

目的:用PCA方法选择HBVDNA多聚酶TP区VH抗体.方法:从YeastDisplayscFvAntibodyLibrary中提取包含scFv抗体库的质粒pPNL6,扩增VH抗体片段.以HepG2.2.15细胞分泌的HBVDNA为模板,PCR扩增HBVDNA末端蛋白(TP).以TP区作为抗原,用PCA方法进行VH抗体选择.结果:PCR扩增的TP区共540bp.对HBVDNA多聚酶TP区进行抗体选择,用PCA方法从抗体库中选择出3个对应抗体,根据DNA序列和WernerMüller数据库可标明3个抗体.结论:对HBVDNA多聚酶TP区进行抗体选择,用PCA方法可以从抗体库中较为简便的选择出对应抗体.

幽门螺杆菌的血清学诊断

目前幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染的实验诊断技术已日益完善,临床上常用的诊断方法包括细菌形态观察,细菌尿素酶活性测定,血清抗 Hp 抗体测定、细胞 DNA 检测及粪便 Hp 抗原检测.毋庸置疑,经内镜取材的标本进行快速尿素酶试验及组织病理学检查是确诊 Hp 感染的常用方法.但侵入性诊断在某些情况下并不适用,因此血清学检测和尿素呼吸试验等无创性检测方法也具广泛用途,而血清学检测被视为流行病学调查的首选方法.

双分子荧光互补试验研究水稻NH1家族蛋白之间相互作用

NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Sys-temic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 homo-logue 1)(NPR1的同源物)可增强抗病性。水稻基因组中还有4个NPR1旁系同源物(Paralog),为NH1的家族蛋白。本试验利用双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC,or split YFP)研究了水稻NH1家族蛋白之间在活体内的相互作用,发现除NH2外,NH1、NH3、NH4和NH5都会和自身的蛋白互作,产生荧光信号,并且它们还会和家族成员的其他蛋白相互结合产生荧光信号。

补体结合酶联免疫吸附试验方法的建立

为改进免疫学诊断技术的准确性,研究了一种基于补体结合的免疫学检测新技术———补体结合酶联免疫吸附试验(CF-ELISA)。CF-ELISA技术采用酶标记抗菊糖纯化豚鼠补体C3抗体及其酶显色系统作为补体参与反应的指示系统,用ELISA方法进行补体结合试验。经对布氏菌病抗体检测的初步试验结果显示,CF-ELISA技术可检测到0.01 IU的布氏菌病抗体,灵敏度与间接酶联免疫吸附试验(iELISA)相当,是虎红平板凝集试验(RBPT)试管凝集试验(SAT)的5 000倍、补体结合试验(CFT)的10 000倍。对349份确诊布氏菌病感染群牛、羊血清的检测结果显示,CF-ELISAi、ELISA、CFT、SAT、RBPT的阳性率分别为35.82%3、6.39%、31.81%、30.09%、36.1%,CF-ELISA与iELISA、CFT、SAT、RBPT的阳性符合率分别为:98.4%、88.8%、80.0%、90.6%。CF-ELISAi、ELISA、CFT、SAT、RBPT对490份布氏菌病阴性群牛、羊血清的阴性率分别为100%、99.6%、100%、99.4%、99.8%,CF-ELISA与iELISA、CFT、SAT、RBPT的阴性符合率分别为:99.6%1、00%、99.4%、99.8%。研究表明,CF-ELISA是具有高特异性和高敏感性的布氏菌病免疫学检测技术。

SLE患者红细胞CR1与IL-8R的表达

目的:研究红细胞CR1和IL-8R在系统性红斑狼疮患者(SLE)中的表达及两者之间的相关性。方法:分别用V型板红细胞离心洗涤免疫酶联法和酶联免疫吸附试验检测活动期SLE患者44例、稳定期SLE42例红细胞CR1及IL-8R的表达,并与健康人作对照,CR1与IL-8R之间的相关性采用Sperman相关分析。结果:活动期SLE患者红细胞CR1和IL-8R较健康人对照组和稳定期SLE患者的表达水平显著下降(P<0.001);稳定期SLE组与健康人对照组比较,CR1和IL-8R分子的表达差异无显著性(P>0.05);活动期SLE的CR1表达与IL-8R的结合活性呈正相关,即活动期SLE的红细胞CR1数量表达和IL-8R的结合活性都显著降低。结论:活动期SLE患者的红细胞CR1免疫识别、黏附、清除CIC能力下降,可能是SLE免疫发病机制中的一个重要环节;CR1及IL-8R在SLE发病机制中可能起重要作用;CR1和IL-8R有可能作为SLE患者病情是否活动、药物疗效判断的一个有价值的辅助指标。

荧光素酶互补法对谷子中SiPKS32/SiCaBP5的互作研究

盐害极大影响了作物的产量和品质。SOS信号途径作为植物耐盐性的重要信号通路,主要包括三类基因,即SOS1、SOS2和SOS3,其中SOS2和SOS3复合物的形成,对于激活SOS1从而行使SOS信号通路维持离子稳态及参与植物抗盐胁迫的功能具有重要作用。谷子作为抗逆耐贫瘠作物,解析其是否存在SOS信号途径及其在盐胁迫下的响应模式具有重要意义。本研究参考已知SOS2、SOS3基因序列,在谷子中同源克隆SOS2基因SiPKS32、SOS3基因SiCaBP5,并进一步构建了SiPKS32、SiCaBP5基因与荧光素酶片段cLUC、nLUC的融合表达载体,利用烟草瞬时荧光素酶互补系统分析基因互作情况。结果显示,SiPKS32与SiCaBP5共侵染烟草可产生荧光,基因间存在互作。该结果为探索谷子中是否存在SOS信号通路及其调控网络,进而为利用基因工程手段培育抗逆作物新品种奠定基础。

补体C3a、C5a在系统性红斑狼疮患者中的表达及与预后的相关性研究

目的探讨补体C3a、C5a在系统性红斑狼疮患者中的表达及与患者预后的相关性。方法选择2015年12月—2016年12月入院治疗的系统性红斑狼疮患者39例,设为观察组,患者均采用波尼松联合环磷酰胺治疗;选择同期入院治疗的健康体检者39名,设为对照组。采用酶联免疫吸附试验测定两组补体C3a、C5a水平;采用SPSS Pearson相关性分析软件对补体C3a、C5a表达水平与患者治疗预后进行相关性分析。结果观察组系统性红斑狼疮患者补体C3a(864.62±16.77)p/(μg/L)、C5a水平(9.69±2.15)p/(μg/L),均高于对照组[补体C3a(700.04±12.10)p/(μg/L)、C5a水平(7.45±2.11)p/(μg/L)](t=15.893,18.242,P<0.05);39例系统性红斑狼疮患者均顺利完成治疗,治疗后32例患者治疗预后良好,7例患者治疗预后相对较差。预后良好患者补体C3a、C5a水平,均低于预后较差者(t=12.091,10.774,P<0.05);SPSS Pearson相关性分析软件结果表明:补体C3a、C5a表达水平与患者治疗预后呈正相关性(r=0.391,0.637,P<0.05)。结论补体C3a、C5a在系统性红斑狼疮患者中呈高表达,且与患者治疗预后呈正相关性。

紫花苜蓿MsMAX2的克隆及功能研究

【背景】分枝是重要的产量构成因子,在紫花苜蓿育种中至关重要。发掘紫花苜蓿分枝相关基因并明确其作用机理,有助于加快紫花苜蓿高产优质育种。MAX2是重要的分枝相关基因,参与多种植物的分枝调控。【目的】通过对紫花苜蓿MsMAX2功能的研究,为建立MsMAX2调控紫花苜蓿分枝发育分子机制奠定基础。【方法】利用同源克隆的方法从紫花苜蓿中获得MsMAX2的基因序列。通过Expy Protparatam、DNAMAN和MEGA-X等软件对MsMAX2进行序列分析并构建系统进化树。采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析MsMAX2在紫花苜蓿中的组织表达特异性。运用烟草瞬时表达系统确定MsMAX2蛋白的亚细胞定位。利用农杆菌介导的转化方法获得转基因拟南芥,以明确MsMAX2的基因功能。用酵母双杂交技术探明与MsMAX2互作的蛋白。【结果】MsMAX2包含长度为2136 bp的开放阅读框,编码由711个氨基酸构成的蛋白,属于F-box蛋白超家族。系统进化分析表明,MsMAX2及其同源基因的进化与物种的分化高度相似,表明其是一个功能保守的基因。MsMAX2在紫花苜蓿的颈部组织中表达量最高,苗期叶片和授粉当天的花序中表达量较高,根中次之,其他组织表达量相对较低,暗示其在紫花苜蓿多个组织中发挥作用。亚细胞定位试验表明MsMAX2蛋白定位于细胞核中。在拟南芥max2突变体中过表达MsMAX2可互补突变体的多分枝表型。酵母双杂交试验表明MsMAX2与激素受体D14存在依赖于独脚金内酯的相互作用。【结论】获得在紫花苜蓿颈部组织中高水平表达的MsMAX2,其编码的蛋白定位于细胞核中;MsMAX2在拟南芥多分枝突变体max2中过表达时,能够互补突变表型,表明MsMAX2参与植物的分枝调控,其功能保守。

母血、乳汁中CTRP3水平与重度子痫前期的相关性研究

目的:探讨母血、乳汁中补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白3(complement-C1q/tumor necrosis factor-related protein 3,CTRP3)水平与重度子痫前期的相关性。方法:选取重度子痫前期患者45例为观察组,无并发症足月分娩的产妇41例作为对照组,收集产前及产后的母体静脉血及产后72 h的乳汁,酶联免疫吸附法检测血清及乳汁中CTRP3水平,分析血清及乳汁中CTRP3水平与重度子痫前期的相关性。结果:观察组产前、产后母血CTRP3水平均明显低于对照组(均P<0.05),两组乳汁CTRP3水平差异无统计学意义(P>0.05)。母血CTRP3水平与乳汁中CTRP3水平无相关性(P>0.05)。结论:母血CTRP3水平与重度子痫前期的发生有关,其降低机制仍需进一步探索。乳汁CTRP3水平与重度子痫前期的相关性并不明确。

经紫外线照射多孔高密度聚乙烯与硅橡胶对大耳白兔耳廓再造术血清总补体活性的影响

目的 比较多孔高密度聚乙烯（Medpor）与硅橡胶经紫外线照射前后血清总补体（CH50）活性的变化,探讨紫外线照射对2种材料生物相容性的影响.方法 将Medpor和硅橡胶分别切成大小为1 cm×1 cm×2 mm的块状,部分材料经紫外线照射.选日本大耳白兔24只随机分成4组,每组6只,无菌条件下每只兔距右耳根3～5 cm处做1.5 cm长的弧形切口,分离并去除约1 cm×1 cm软骨,实验1组植入未经紫外线照射的硅橡胶,实验2组植入经紫外线照射的硅橡胶,实验3组为植入未经紫外线照射的Medpor,实验4组植入经紫外线照射的Medpor.于术前3 d和术后1、3、7、14、21、30、60、90 d分别检测CH50含量.结果 4组术区均有不同程度的炎性反应或充血.实验1组和实验2组术后各时间点血清CH50值均低于术前3 d,实验3组和实验4组术后1、3 d低于术前3 d,实验1组和实验2组术后各时间点血清CH50值均分别低于实验3组和实验4组,实验4组术后1、3、7 d血清CH50值高于实验3组,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 紫外线照射可以改善Medpor的CH50值,促进其与组织的相容性,对硅橡胶无明显改善作用.

选择HBV DNA多聚酶TP区VH抗体的一种新方法:蛋白片段互补法

目的:用PCA(Prote in fragm ent comp lem entation assay,PCA,蛋白片段互补方法)选择HBV(Hepatitis B virus)多聚酶TP(Term inal prote in,TP,末端蛋白)区VH(Variab le fragm ents of heavy chain,VH,重链可变区)抗体。方法:用HepG2.2.15细胞分泌的HBV的多聚酶TP区作为抗原,用PCA方法进行VH抗体选择。抗原与抗体基因分别与二氢叶酸还原酶(DHFR)的两部分相连。特异性抗原、抗体相互识别,分别与他们相连的酶基因就会接触而恢复完整的DHFR酶活性,细菌得以存活。结果:对HBV DNA多聚酶TP区进行抗体选择,用PCA方法从抗体库中选择出3个对应抗体。3个TP区抗原特异性抗体有不同的氨基酸序列。结论:对HBV DNA多聚酶TP区进行抗体选择,用PCA方法可以从抗体库中较为简便的选择出对应抗体。PCA可以作为一个从抗体库中选择特异性抗体的强有力方法。

人血清补体C3、C4定时散射比浊分析检测试剂的研制

目的建立人血清补体C3、C4定时散射比浊分析方法。方法采用定时散射比浊分析法检测临床血清标本,并对试剂的各项性能指标进行评价。结果补体C3试剂盒的测定范围为0.945～1.776g/L,灵敏度为0.022g/L,批内批间的精密度分别为2.5%～4.8%,5.4%～7.1%。样本中的游离血红蛋白、胆红素、甘油三酯等干扰物浓度达到10g/L、600mg/L、57g/L时对检测结果无显著性影响,42份异常血样用自制试剂盒与进口DadeBehring试剂盒同时检测,其相关系数为0.985;补体C4试剂盒的测定范围为0.096～0.435g/L,灵敏度为0.0014g/L,批内批间的精密度分别为1.8%～2.2%,3.8%～5.2%。样本中的游离血红蛋白、胆红素、甘油三酯等干扰物浓度达到10g/L、600mg/L、24g/L时对检测结果无显著性影响,42份异常血样用本试剂盒与进口Dade Behring试剂盒同时检测,其相关系数为0.991。结论补体C3、C4散射比浊试剂盒各项指标均达到临床检测要求,与Dade Behring同类试剂测定结果有较好的相关性,在临床上有极大的应用前景,有望替代国外同类产品试剂盒。

应用酵母双杂交方法筛选与猪瘟病毒N^(pro)蛋白相互作用的宿主蛋白

为研究猪瘟病毒(CSFV)与宿主细胞间的相互作用,本研究采用酵母双杂交方法以猪瘟病毒Npro蛋白为诱饵,从猪外周血单个核细胞(PBMC)cDNA表达文库中筛选与之相互作用的蛋白,经共转化试验表明,共筛选到12个与Npro蛋白相互作用的宿主蛋白,应用Cytoscape 2.8.2软件绘制了蛋白质间相互作用关系图,根据GO分析结果,这些蛋白分别参与细胞代谢、细胞生长、免疫等过程,经双分子荧光互补(BiFC)试验表明筛得的部分宿主蛋白与CSFV Npro具有相互作用。本研究中筛选得到的蛋白质对CSFV复制的影响有待进一步深入研究。

人衰变加速因子在CHO细胞的表达及其衰变加速活性研究

目的 获得稳定表达人衰变加速因子 (humandecay acceleratingactivity ,hDAF)的中国仓鼠卵巢 (Chineseham sterovary ,CHO)细胞系 ,观察在补体活化情况下 ,hDAF对异种细胞的保护作用。方法 构建真核表达载体DAF pcDNA3 .1,用脂质体转染法将其导入CHO细胞 ,有限稀释法筛选稳定表达hDAF的单细胞克隆 ,流式细胞仪检测hDAF的表达 ,C3沉积实验和51 Cr释放法测定其促补体衰变活性。结果 成功构建了真核表达载体DAF pcDNA3 .1,并获得了表达hDAF的单细胞克隆 ,表达hDAF的CHO能减少补体C3的沉积 ,减弱补体的杀伤作用。结论 获得在细胞膜上稳定表达具功能活性的hDAF的CHO克隆 ,为进一步研究其结构与功能的关系准备了条件。