目的使用RNA干扰技术阻断人卵巢癌HO-8910细胞中Cyclin E的表达,分析Cyclin E表达受抑制后产生的一些效应,采用双向凝胶电泳和质谱技术分析鉴定转染前后细胞内差异表达的蛋白质,探讨Cyclin E在人卵巢癌细胞增殖中的作用,以期为人卵巢癌...目的使用RNA干扰技术阻断人卵巢癌HO-8910细胞中Cyclin E的表达,分析Cyclin E表达受抑制后产生的一些效应,采用双向凝胶电泳和质谱技术分析鉴定转染前后细胞内差异表达的蛋白质,探讨Cyclin E在人卵巢癌细胞增殖中的作用,以期为人卵巢癌发生、发展、诊断与治疗提供有价值的资料。方法构建质粒表达载体pU6-Cyclin E-siRNA,同时设立阴性对照组和空白对照组。采用脂质体转染法稳定转染卵巢癌HO-8910细胞,G418筛选阳性克隆细胞;噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长曲线的改变;RT-PCR法比较转染前后Cyclin E mRNA的表达量的变化;双向凝胶电泳-图像分析-质谱技术-数据库搜索,比较转染前后蛋白质组表达的变化,鉴定差异显著的蛋白点。结果 1)成功构建了Cyclin E干扰RNA的重组质粒并获得稳定转染组细胞HO-8910-Cyclin E siRNA。2)稳定转染组HO-8910-Cyclin E siRNA细胞与阴性对照组HO-8910-neo细胞和空白对照组相比,细胞生长速度减慢,Cyclin E mRNA表达水平降低。3)通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到稳定转染组低表达蛋白5个,经数据库搜索分别是锌指蛋白ZFP-36、波形蛋白、肿瘤拒绝抗原gp96、未知蛋白、DNA校正蛋白酶Ⅱ。结论Cyclin E干扰RNA干扰后卵巢癌HO-8910细胞Cyclin E基因的表达明显降低,细胞增殖能力减弱。差异表达的蛋白质参与细胞的增殖、细胞信号转导调节,并与肿瘤的发生、发展、诊断密切相关。展开更多
An important interface modification for capillary isoelectric focusing mass spectrometry(CIEF MS) is reported. A capillary needle with a sheath flow tube pre mounted in one device serves as both the CIEF cathodic end ...An important interface modification for capillary isoelectric focusing mass spectrometry(CIEF MS) is reported. A capillary needle with a sheath flow tube pre mounted in one device serves as both the CIEF cathodic end and the ESI interface. The needle was inserted into the cathode reservoir at the focusing stage, and then removed to the front of sampler orifice of MS at the detection stage. Therefore, the shut off of the high voltage is not necessary and a better focusing protein zone is maintained during the ESI stage. The optimization of the experimental condition has been investigated and the two dimensional image of the E. coli proteins has been obtained, which is comparable with that from a 2D gel.展开更多
目的：建立UPLC／Q-TOF-MS法鉴定市售凝血酶冻干粉中的蛋白组分并进行定量。方法：样品经胰蛋白酶消化后的多肽混合物，用超高效液相色谱进行分离，并在线进入ESI—Q—TOF—MS检测，获得的肽段一级母离子和碎片离子的高分辨准确质量数据...目的：建立UPLC／Q-TOF-MS法鉴定市售凝血酶冻干粉中的蛋白组分并进行定量。方法：样品经胰蛋白酶消化后的多肽混合物，用超高效液相色谱进行分离，并在线进入ESI—Q—TOF—MS检测，获得的肽段一级母离子和碎片离子的高分辨准确质量数据（MS^E方法），经ProteinLynx Global Server（PLGS2．4）软件蛋白质谱库检索，确定其中的蛋白组分，再以Hi3非标记蛋白定量方法对各蛋白组分进行定量，得到质量百分比定量结果。结果：在以猪血为原料生产的26批凝血酶冻干粉中，鉴定出人血白蛋白和21种猪源蛋白，其中，有1家企业的3批样品中鉴定出猪和人血浆成分，其余23批次样品均为猪血浆成分；样品中的猪凝血酶含量在1．9％～43．7％之间。在以牛血为原料生产的3批凝血酶冻干粉中共鉴定出17种牛源蛋白；样品中的牛凝血酶含量在49．4％～77．6％之间。结论：UPLC／Q-TOF—MS法灵敏度高，选择性好，通过一次分析可对凝血酶冻干粉中蛋白组分同时进行定性和定量，并可获得有关工艺相关的数据信息如来源和种属等，可用于本品的工艺研究以及质量控制研究。该法可以作为同类生化药物质量研究和组分分析的方法。展开更多
文摘目的使用RNA干扰技术阻断人卵巢癌HO-8910细胞中Cyclin E的表达,分析Cyclin E表达受抑制后产生的一些效应,采用双向凝胶电泳和质谱技术分析鉴定转染前后细胞内差异表达的蛋白质,探讨Cyclin E在人卵巢癌细胞增殖中的作用,以期为人卵巢癌发生、发展、诊断与治疗提供有价值的资料。方法构建质粒表达载体pU6-Cyclin E-siRNA,同时设立阴性对照组和空白对照组。采用脂质体转染法稳定转染卵巢癌HO-8910细胞,G418筛选阳性克隆细胞;噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长曲线的改变;RT-PCR法比较转染前后Cyclin E mRNA的表达量的变化;双向凝胶电泳-图像分析-质谱技术-数据库搜索,比较转染前后蛋白质组表达的变化,鉴定差异显著的蛋白点。结果 1)成功构建了Cyclin E干扰RNA的重组质粒并获得稳定转染组细胞HO-8910-Cyclin E siRNA。2)稳定转染组HO-8910-Cyclin E siRNA细胞与阴性对照组HO-8910-neo细胞和空白对照组相比,细胞生长速度减慢,Cyclin E mRNA表达水平降低。3)通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到稳定转染组低表达蛋白5个,经数据库搜索分别是锌指蛋白ZFP-36、波形蛋白、肿瘤拒绝抗原gp96、未知蛋白、DNA校正蛋白酶Ⅱ。结论Cyclin E干扰RNA干扰后卵巢癌HO-8910细胞Cyclin E基因的表达明显降低,细胞增殖能力减弱。差异表达的蛋白质参与细胞的增殖、细胞信号转导调节,并与肿瘤的发生、发展、诊断密切相关。
文摘An important interface modification for capillary isoelectric focusing mass spectrometry(CIEF MS) is reported. A capillary needle with a sheath flow tube pre mounted in one device serves as both the CIEF cathodic end and the ESI interface. The needle was inserted into the cathode reservoir at the focusing stage, and then removed to the front of sampler orifice of MS at the detection stage. Therefore, the shut off of the high voltage is not necessary and a better focusing protein zone is maintained during the ESI stage. The optimization of the experimental condition has been investigated and the two dimensional image of the E. coli proteins has been obtained, which is comparable with that from a 2D gel.
文摘目的：建立UPLC／Q-TOF-MS法鉴定市售凝血酶冻干粉中的蛋白组分并进行定量。方法：样品经胰蛋白酶消化后的多肽混合物，用超高效液相色谱进行分离，并在线进入ESI—Q—TOF—MS检测，获得的肽段一级母离子和碎片离子的高分辨准确质量数据（MS^E方法），经ProteinLynx Global Server（PLGS2．4）软件蛋白质谱库检索，确定其中的蛋白组分，再以Hi3非标记蛋白定量方法对各蛋白组分进行定量，得到质量百分比定量结果。结果：在以猪血为原料生产的26批凝血酶冻干粉中，鉴定出人血白蛋白和21种猪源蛋白，其中，有1家企业的3批样品中鉴定出猪和人血浆成分，其余23批次样品均为猪血浆成分；样品中的猪凝血酶含量在1．9％～43．7％之间。在以牛血为原料生产的3批凝血酶冻干粉中共鉴定出17种牛源蛋白；样品中的牛凝血酶含量在49．4％～77．6％之间。结论：UPLC／Q-TOF—MS法灵敏度高，选择性好，通过一次分析可对凝血酶冻干粉中蛋白组分同时进行定性和定量，并可获得有关工艺相关的数据信息如来源和种属等，可用于本品的工艺研究以及质量控制研究。该法可以作为同类生化药物质量研究和组分分析的方法。
