3种甜樱桃病毒PNRSV、PDV及LChV-2的多重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立可同时检测李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、樱桃小果病毒2(Little cherry virus-2,LChV-2)的多重RT-PCR检测方法。【方法】以复合感染3种病毒的甜樱桃病株叶片为材料,采用CTAB法提取样本总RNA,选用随机六聚体引物对植物样本总RNA进行反转录,所得cDNA作为多重RT-PCR的扩增模板。根据GenBank中PNRSV、PDV、LChV-2基因组序列共设计6对特异引物,分别通过单一RT-PCR和多重RT-PCR筛选出可用于同时检测3种甜樱桃病毒的引物组合。对多重RT-PCR的退火温度及循环数进行优化,以筛选出各引物组合的最适扩增条件。分别以单一感染PNRSV、PDV、LChV-2、复合感染3种病毒、单一感染樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)及甜樱桃无毒苗为样本,对多重RT-PCR引物的特异性进行分析。选取复合感染3种病毒的甜樱桃总RNA的反转录产物为初始模板,按照梯度稀释法依次将模板稀释为2、22、23、24、25倍,在相同PCR反应体系及反应条件下分别对各引物组合的灵敏度进行分析。多重RT-PCR的扩增条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接至pMD18-T vector,克隆测序,以验证多重RT-PCR检测的准确性。并应用该方法对山东泰安地区甜樱桃生产园中间隔栽培的中国樱桃进行检测。【结果】筛选到2个可以应用的引物组合,组合1"PNRSV-S1/A1、PDV-S2/A2、LChV2-S1/A1"可分别特异性地扩增733、467、337 bp的片段。组合2"PNRSV-S1/A1、PDV-S3/A3、LChV2-S1/A1"可分别扩增得到733、265、337 bp的片段。扩增产物大小与预期相符。多重RT-PCR反应条件优化结果显示,在退火温度52℃、35个循环条件下,2个引物组合的检测效果均较为理想。特异性分析结果显示,2个引物组合均能特异性检测其各自的靶病毒。灵敏度分析结果显示,2个引物组合在cDNA的23×稀释液中仍能特异性扩增,但扩增条带的强度稍有差异,其对植物总RNA的反转录产物的最低检测浓度为107.9 ng·μL-1。克隆测序及序列分析表明,2个引物组合对各自靶病毒的检测结果可靠。应用该方法对9个中国樱桃样本进行检测,结果显示,测试样品均至少感染了2种病毒,其中5个样品复合感染了3种病毒,2个样品同时感染PDV和LChV-2,2个样品同时感染PNRSV和LChV-2。【结论】应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏的同时检测单一或复合侵染的3种甜樱桃病毒。

李属坏死环斑病毒怀柔分离物(PNRSV-HR)外壳蛋白基因片断的克隆与序列分析

应用RT-PCR方法检测了采自北京市怀柔区的樱桃叶片,将此PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上,通过转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,克隆了含有目的片段的重组质粒,并进行序列测定和分析。序列分析结果表明,认为该分离物外壳蛋白基因片断与李属坏死环斑病毒的NRSiz8株系的同源性最高,为98%,与德国分离物Ring17的同源性达99%;通过进化关系分析,认为该分离物属于引起温和症状的group,认为该分离物的第5,62,81和126位氨基酸也与CH9血清型引起温和症状的保守的替换相同。

李属坏死环斑病毒(PNRSV)RT-LAMP检测方法的建立

针对李属坏死环斑病毒(PNRSV)外壳蛋白(CP)基因保守序列,设计了1套特异性识别CP基因中6个不同区段的环介导等温扩增(LAMP)引物。通过对反应条件的优化,建立了适用于PNRSV的RT-LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,此方法能够特异性的检测出PNRSV,对马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)的检测均为阴性,灵敏度高于RT-PCR 10倍。

李属坏死环斑病毒(PNRSV)新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因(CP)片断的克隆与序列分析

【目的】为了查明新疆巴旦木果树病原病毒的种类,为病毒的分子检测提供基础。【方法】采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),从巴旦木果树叶片中检测到李属坏死环斑病毒(PNRSV)。以阳性样品的总RNA为模板进行PNRSV外壳蛋白基因(CP)RT-PCR扩增,对预期430 bp大小的4个扩增产物进行克隆、测序和序列分析。【结果】结果表明,PNRSV新疆巴旦木分离物CP基因的核苷酸和氨基酸序列与世界各地已报道的分离物具有较高的同源性,分别为80.0%～97.2%和80.1%～94.1%,其中与阿根廷分离物AY217的同源性最高;而与同属03亚组的苹果花叶病毒(ApMV)同源性较低,仅为52.9%～55.4%和45.6%～48.6%。新疆PNRSV各分离物之间CP基因高度同源。序列比对与系统发生树的分析显示,PNRSV新疆巴旦木分离物的株系属于GroupⅠ组。【结论】确定了PNRSV为侵染新疆巴旦木果树的病原病毒。这是PNRSV在新疆发现的首次报道。

RT-PCR检测李坏死环斑病毒的研究

为了从植物组织中快速检测李坏死环斑病毒 (PNRSV) ,根据该病毒RNA 3序列设计引物 ,对感病和健康组织总RNA进行RT PCR ,结果从感病组织中扩增出了大约 45 0bp的目的片段 ,而健康组织中无此扩增带。将此PCR产物连接到 pGEM T easy载体 ,转化大肠杆菌DH5 5α菌株 ,得到了含有目的片段的重组子 ,并采用双脱氧终止法进行序列分析 ,结果与美国报道的李坏死环斑病毒RNA3序列对应部分核苷酸基本一致 (其同源性达 93.6 %) ,这表明应用RT PCR来检测李坏死环斑病毒是可行的 ;PCR产物克隆作为RT PCR反应的阳性对照解决了检疫对象不能扩散的问题 ,从而建立了RT

浙江海宁月季上发现李属坏死环斑病毒

采用双夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),对杭州、嘉兴、绍兴3市6县(市、区)的果树园林植物进行李属坏死环斑病毒病的病情调查,采集检测样品包括樱桃、桃、李、杏和月季等12种寄主植物共计102个。结果表明,10个海宁月季样品的ELISA结果呈阳性,其他样品呈阴性;阳性样品经RT-PCR检测和CP基因测序验证,确认海宁月季感染了李属坏死环斑病毒。

李坏死环斑病毒检测方法的比较研究

针对感染李坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)植株病毒的特异性检测,将DAS- ELISA、RT-PCR方法综合改进、优化,建立了免疫捕获反转录PCR(IC-RT-PCR)检测PNRSV的方法.该方法采用PNRSV抗体特异性免疫捕获病毒,并根据GenBank中PNRSV序列设计的特异性引物对PN5/PN3进行PCR扩增,得到约760 bp大小的特异性基因片段.扩增产物经克隆测序后,结果表明:产物序列与PNRSV的外壳蛋白编码基因存在94%～98%的同源性.检测广泛性以及灵敏度比较研究显示.IC-RT-PCR方法能从含量很低的受病样品中检出PNRSV,检测灵敏度与RT-PCR相近,但所检测样品的范围更广,适用于从植物各部位检测低含量的病毒.IC-RT-PCR检测灵敏度比DAS-ELISA方法高出1000倍.

四个李属坏死环斑病毒分离物的检测鉴定及CP基因序列分析

采用RT-PCR方法,从北京昌平、云南昆明、陕西西安和浙江海宁的樱桃和月季罹病叶片中检测到李属坏死环斑病毒,为分析我国李属坏死环斑病毒分子生态学特性,克隆了病毒分离物的CP基因并进行序列分析。结果显示,北京分离物的CP基因长675nt、编码224aa,而西安、昆明和海宁分离物的CP基因均为681nt、编码226aa。序列相似性分析表明,4个分离物的CP基因之间具有很高的同源性,各个分离物间的核苷酸同源性在94.8%～99.3%之间,氨基酸同源性在94.2%～98.7%之间。序列比对与系统发生树的分析结果显示,北京分离物属于GroupⅡ组,昆明、西安和海宁分离物属于GroupⅠ组。

李属坏死环斑病毒新疆分离物运动蛋白基因片段的克隆与序列分析

为进一步揭示李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）新疆巴旦木分离物的分子特征、遗传变异及其与宿主之间的相互关系,采用RT-PCR方法扩增并克隆了4个PNRSV新疆巴旦木分离物运动蛋白（move protein,MP）基因片段,并进行了测序及序列同源性分析。结果表明,4个新疆巴旦木PNRSV分离物MP基因片段分别为259、258、254、260 bp;其核苷酸和氨基酸序列与已报道的PNRSV分离物的同源性分别为72.7%~91.7%和75.6%~92.9%,表现出明显差异,其中与美国分离物CH9同源性最高,分别达88.8%~91.7%和82.6%~92.9%;而与同属03亚组的苹果花叶病毒（Apple mosaic virus,Ap MV）同源性较低,仅为51.2%~58.1%和52.3%~61.9%;新疆PNRSV各分离株之间MP基因核苷酸序列同源性较高。系统发育树显示,4个新疆巴旦木PNRSV分离物与Ⅰ组代表毒株PV32的核苷酸序列同源性达88.4%~91.3%,并与Ⅰ组分离物聚集成簇,表明PNRSV新疆巴旦木分离物属于引起严重症状的Ⅰ组株系,且Ⅰ组中各分离物之间表现出一定的寄主相关性,而Ⅱ组和Ⅲ组中各分离物之间未表现出明显的寄主相关性。