肺炎链球菌表面黏附素A的原核表达及免疫保护性研究

目的利用基因工程技术获取原核表达的肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)蛋白并初步研究其对小鼠的免疫保护性。方法根据基因库中psaA基因序列设计合成特异性引物,从临床分离到的肺炎链球菌中提取DNA,PCR技术扩增目的基因psaA,克隆后构建原核表达载体PET-32a(+)/psaA,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,获得重组蛋白,并通过Western-blot鉴定其免疫活性。将重组蛋白免疫小鼠,观察对肺炎链球菌感染动物的保护作用。结果经酶切及测序鉴定,克隆出870bp的目的基因,DNA序列与Gen-Bank中的相应数据符合率为100%;成功构建出原核表达载体pET-32a/psaA;经IPTG诱导,表达出了约57kD左右的融合蛋白,与预期大小相符,并且具有抗体结合活性;重组PsaA蛋白对肺炎链球菌感染小鼠具有一定保护作用。结论在原核细胞中成功表达出PsaA蛋白,能在一定程度上抵抗肺炎链球菌感染,为基于黏附素的新型疫苗的研究提供线索。

鼠疫菌PsaA抗原的表达及抗体制备和应用

目的:制备鼠疫菌PsaA抗原及抗体,建立针对PsaA抗体的快速检测方法,并检测鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率。方法:利用PCR方法扩增出PsaA蛋白基因片段,在大肠杆菌原核表达系统中表达出重组PsaA抗原,以镍柱亲和层析纯化包涵体形式的表达蛋白,以尿素梯度透析复性成可溶蛋白。再以表达蛋白为免疫原,常规免疫家兔,收集兔血清制备多抗,并以正辛酸-硫酸铵法提纯获得PsaA抗体IgG。利用得到的PsaA抗原和抗体为材料,建立两种检测PsaA抗体的快速检测方法,即间接ELISA法和上转换发光(Up-converting Phospher Technology,UPT)免疫层析试纸条法。最后利用这两种方法检测18份猴血清标本中的PsaA抗体。结果:鼠疫菌感染猴血清标本中PsaA抗体的阳性率为62%(8/13)。结论:成功建立了针对鼠疫菌PsaA抗体的快速检测方法,并检测到13份鼠疫感染猴血清标本中的PsaA抗体的阳性率为62%。

肺炎链球菌表面抗原PsaA-PspA融合蛋白双抗夹心ELISA定量检测方法的建立及验证

目的建立快速测定肺炎链球菌表面抗原PsaA-PspA融合蛋白含量的双抗夹心ELISA方法,并进行验证。方法制备PsaA-PspA抗原,确定PsaA单抗和PsaA-PspA兔多抗的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA方法。对方法的抗原特异性、精密性和准确性进行验证,并分析变性抗原对测定的影响。结果单抗和兔多抗最佳稀释倍数为1∶500和1∶10 000。建立的双抗夹心ELISA法检测PsaA-PspA抗原的浓度范围为70~560 ng/m L,R^2为0.993 8;该方法不适用于其他抗原的测定,但可用于鉴定抗原是否变性;该方法检测不同批次PsaA-PspA抗原的批内平均变异系数(CV)为4.9%,批间平均CV为19%,平均回收率为88.98%。结论建立的双抗夹心ELISA方法特异性、精密性和准确性良好,可用于PsaA-PspA融合蛋白浓度的检测,且可检测抗原是否变性。