冠突伪尾柱虫(Pseudourostyla cristata)接合生殖的研究 Ⅰ.核器演化

在25℃条件下,冠突伪尾柱虫接合生殖全程历时10天左右。接合生殖过程中的核器演化包括:①数十枚老的大核逐步瓦解。电镜观察表明,老的大核是以一种类似于食物泡消化的方式被吸收的,并在此过程中伴有大量溶酶体出现。②仅8枚左右小核中的一枚参与新核器的发生。首先,位于胞口后部的一枚小核膨大并进行一次预备分裂,接着发生三次成熟分裂。每一接合体内形成一枚雄原核和一枚雌原核。雄原核互向对方迁移并与其雌原核融合成为合子核。合子核分裂两次,四枚子核之一发育为大核原基,另一枚发育为小核原基,其余两枚退化。预备分裂和前两次成熟分裂各自产生的两枚子核中,仅一枚进入下一次分裂,另一枚解体消失。在第一次成熟分裂前期,“降落伞”的形成和发展经历着复杂的结构变化,持续一小时以上。③大核原基经过长时间的发育,伴有多线染色体的形成和解体等一系列变化,方达成熟状态。成熟的大核原基以伸长断裂、分叉断裂和哑铃形缢缩三种方式进行分裂,小核原基亦随之分裂,逐步形成具60枚左右大核、8枚左右小核的正常营养体。其后,大核融合,开始配后第一次无性分裂。值得注意的是,大核原基发育到将成熟时,最初的迹象是染色质向大核原基中央集结成团,染色质团与核膜之间充满着匀质的核液。

冠突伪尾柱虫(Pseudourostyla cristata)接合生殖的研究

冠突伪尾柱虫行暂时接合,两接合体融合的部位为额下区,与其它腹毛类纤毛虫所发现的不对称接合方式不同。该种接合双方的排列是对称的。从比较分析中我们发现,纤毛器吸收的模式决定于接合方式。在为期10天左右的接合生殖过程中,共发生三次皮膜更新。第一次改组开始于第二次成熟分裂的前中期。这次改组中,各类纤毛器原基产生的部位、时序与无性分裂时的后仔虫基本相同。第二次更新发生于大核原基内染色质向中央聚集时。这次更新是在旧的纤毛器和毛基粒完全丧失数天之后重新发生的。第三次改组发生于具10枚左右大核的时候(另一种情况则发生于成熟大核原基缢缩呈哑铃形或三节串珠形时)。这次改组是以一种类似于生理改组的方式进行的。第一和第二次皮膜形态发生具有不成熟的特点,即各种纤毛器的个员数趋于减少,甚至缺如。第三次改组完成后,各种纤毛器恢复到原来的水平。皮膜改组和核器发生之间没有发现严格的相关性,二者似乎是以两个相对独立的系统分别进行的。

冠突伪尾柱虫(Pseudourostyla cristata)实验再生研究

冠突伪尾柱虫(Pseudvurostyla cristata) 含约70枚大核。我们用显微手术横切G1期细胞,得前后两块相等断片;分别培养。60小时后,断片再生完成。在再生过程中,随细胞体积增大,大核数目也增加。大核的数目和细胞体积存在着一定的均衡关系。在细胞无性分裂过程中,许多大核改组后,融合成一个融合大核。这个融合大核具两个仔虫的大核数目和DNA量。我们用显微手术得到含融合大核的后断片。在后断片再生后恢复的虫体内,我们发现本应分配到两个仔虫中去的大核数目,被限制在一个虫体的大核数目上。这说明了细胞质可以影响和调节大核的数目。并还证明了这种虫体大核DNA量较正常虫的大核DNA量约多一倍。其中大部分虫体分裂时,大核不经改组就开始融合和分裂;从而使DNA量回复正常。同讨还发现小部分虫体通过排出大核多余核物质方式来调节大核DNA量。这些现象说明了细胞核质之间存在着一种调节相对平衡和相互协调的机制。

冠突伪尾柱虫的腹皮层纤毛器微管胞器及其形态发生

应用荧光紫杉醇直接荧光标记和抗α-微管蛋白抗体免疫荧光标记方法,显示冠突伪尾柱虫腹皮层纤毛器微管胞器由口围带、波动膜、额腹横棘毛和左右缘棘毛等纤毛器微管、纤毛器基部附属微管等组成。口围带基部含小膜托架及与托架相联系的肋壁微管,其中领部小膜托架间由"∧"形微管相联接;额腹横棘毛基部含前纵微管束、后纵微管束、横微管束和周围微管束,其微管在不同棘毛基部的发达程度不一,其中两列中腹棘毛基部微管紧密联系成一条粗绳索样结构,且左、右中腹棘毛基部的横微管束定向相反;左、右缘棘毛基部含前纵微管束、后纵微管束和横微管束,其中横微管束不发达。与目前已知的腹毛目纤毛虫例如贻贝棘尾虫、魏氏拟尾柱虫的纤毛器基部微管相比较,冠突伪尾柱虫腹皮层纤毛器基部微管除具有腹毛目纤毛虫纤毛器基部微管的基本特征外,也具有一些特殊的组成模式。皮层纤毛器微管形态发生中,前仔虫口围带并非全部是由老口围带更新而来的,其老口围带只有翻领部发生更新,且翻领部与领部接续处有一小段老的翻领部小膜保留,领部的小膜保留,结果其领部小膜、接续处保留的小膜与更新的翻领部小膜三部分共同组成前仔虫的新口围带。在后仔虫口原基发生的位置,其邻近的老横棘毛没有变化,此时老的横棘毛或许能起到"参照点"或定位作用;各类纤毛器发生、分化过程中,处于非原基区的老额棘毛、横棘毛及左右缘棘毛在较长时间内均未见明显的变化。它们可能是在新结构形成时仍然起到运动作用继而逐渐失去功能而退化瓦解的。

冠突伪尾柱虫营养期和形成包囊期间细胞的超微结构

冠突伪尾柱虫营养细胞中含有轴杆样结构。细胞形成包囊期间 ,胞质内发生自噬作用 ,并产生由许多膜管聚集在一起组成的高尔基体 ,在高尔基体内其分泌物质聚集成高电子密度的嗜锇晶体。细胞分化的结果形成含颗粒层、内层壁和外层壁的“尾柱虫类包囊”。

冠突伪尾柱虫有性生殖期间皮膜发育的核控制

通过显微手术去小核建立多个冠突伪尾柱虫 (Pseudourostylacristata)无小核细胞系 ,并诱导它们与有小核细胞进行接合生殖 ,以评估小核及其衍生的大核原基在有性生殖期间对皮膜形态发生的影响。当无小核接合体从有小核配偶获得 1枚配子核后 ,接合双方不仅能平行地继续核器演化 ,而且使第 1次皮膜改组能够同步进行和正常发育 ,说明小核在有性周期中除了生殖功能外仍保留着某些控制皮膜发育的体功能。虽然大部分接合后体的大核原基在DNA贫乏期停止发育 ,但少数接合后体能够超越这一时期 ,并启动第 2次皮膜改组和顺利完成其后续的有性发育全程 ,表明指令发动第

大型纤毛虫总RNA的提取方法

以冠突伪尾柱虫为材料 ,建立了一种适合于富含RNase和多糖的大型纤毛虫总RNA的提取方法。该方法采用异硫氰酸胍和 β 巯基乙醇联合快速变性 ,酚、氯仿和异戊醇抽提 ,同时在变性剂存在的条件下两次选择性地沉淀RNA ,从而有效地去除了DNA、蛋白质和多糖。所得RNA样品经电泳、紫外分光光度法检测和RT PCR分析 ,证实为完整、均一且无基因组污染的总RNA。这为构建冠突伪尾柱虫有小核系与无小核系之间的削减文库、筛选两细胞系差异表达的基因奠定了基础。

冠突伪尾柱虫休眠与营养细胞线粒体DNA的比较

为研究纤毛虫休眠状态下线粒体的行为特征及功能与纤毛虫形成包囊的关系,采用RAPD技术对冠突伪尾柱虫休眠细胞与营养细胞的线粒体DNA进行了比较。结果表明,在选用的15条随机引物中,有5条引物的扩增产物完全相同,其余10条引物的扩增产物各有差异。15条引物共扩增出84条片段,其中共享片段为28条,共享度为66.67％。这说明休眠细胞线粒体DNA与营养细胞线粒体DNA在很大程度上是一致的,但仍存在一定差异,据此推测细胞在形成包囊的过程中,某些线粒体DNA结构可能发生了改变,这些改变可能与线粒体在包囊内的行为特征及功能有关。

冠突伪尾柱虫小核对胞口结构稳定性的影响

在通过显微手术所建立的冠突伪尾柱虫 (Pseudourostylacristata)无小核系中 ,部分细胞因口围带翻领部小膜出现不同程度的缺损而导致畸形 ;在细胞生长静止期的群体中 ,口围带畸形率高达 5 0 %以上 ;对无小核系 6 0 0多个刚完成二分裂的前、后仔虫及 10 0 0多个生理改组末期的虫体进行蛋白银染色观察 ,除发现 4个二分裂仔虫和 3个生理改组后虫体的口围带异常外 ,绝大多数经过形态发生后的细胞都具有正常的胞口结构。另一方面 ,选择性培养实验进一步证明 ,口围带畸型产生于非形态发生期。由此可见 ,失去小核的细胞 ,同时也失去了胞口结构的稳定性。

冠突伪尾柱虫接合过程中小核的形态发生作用

为查明有性生殖期间小核对形态发生的影响程度和范围 ,我们利用蛋白银染色对冠突伪尾柱虫不同交配型无小核体之间的接合过程进行了跟踪观察。结果表明 :无小核细胞的交配反应能力明显下降 ;接合双方第一次皮膜形态发生如常进行 ,但纤毛器原基分化往往出现异常 ;接合后体照常进入拟包囊阶段 ,但原有纤毛器多不从皮膜上消失 ;由于没有新核器形成 ,均不能启动第二次形态发生并于拟包囊早期解体死亡。因此 ,小核对于维持接合早期及第一次皮膜改组的正常进行具有某些明显作用 。

冠突伪尾柱虫生理改组中口器发生及口围带调节重建的研究

在冠突伪尾柱虫生理改组过程中，口器发生分波动膜形成和口围带重建两方面独立进行。前者发生包容了旧波动膜解聚、胞咽壁新产生和左列腹棘毛解体等三个部位的毛基粒；后者重建则由口围带原基新分化的小膜、经过裁剪修饰后的旧翻领部和领部三者拼接整合而成。新小膜的添加与旧小膜的减少二者之间所达致的平衡保证了生理改组后口围带结构的稳定性。

三种纤毛虫细胞内酸性磷酸酶的定位观察

利用电镜酶细胞化学方法,对大尾柱虫(Urostylagrandis)、冠突伪尾柱虫(Pseudourostylacristata)、魏氏拟尾柱虫(Paraurostylaweissei)三种纤毛虫细胞内的酸性磷酸酶(ACPase)进行了定位观察。发现在它们体内ACPase的阳性反应颗粒除分布在消化腔隙内独立的泡状结构上和被消化的食物组织中外,在细胞质中的小圆泡内也有分布。所得结果证实了消化腔隙和小圆泡都具有消化功能。作者推测消化腔隙主要消化食物,小圆泡则可能与自身物质(如衰老胞器等)的消化有关;并推测这种消化腔隙与小圆泡共存是纤毛虫消化胞器由食物泡演化为消化腔隙系统的中间形式。此外,在大尾柱虫纤毛内部观察到非溶酶体性的ACPase。

筛选冠突伪尾柱虫有小核细胞系和无小核细胞系饥饿期差异表达的ESTs

利用显微切割的方法建立大型腹毛目纤毛虫———冠突伪尾柱虫(Pseudourostyla cristata)的无小核细胞系,分别提取有小核和无小核细胞系的总RNA,用SMART-PCR方法直接合成dscDNA,进而运用抑制性消减杂交技术(Sup-pression subtractive hybridization,SSH)对冠突伪尾柱虫去小核前后的差异表达基因进行研究,构建了有与无小核细胞系在饥饿期差异表达基因的消减文库,随机挑取了284个克隆,应用cDNA阵列技术鉴定阳性克隆。将鉴定出的17个阳性克隆进行Blastx分析,结果表明17个EST(Expressed sequence tag)均可能与小核体功能密切相关,此为进一步阐明小核的遗传机理奠定了基础。

伪尾柱虫有性周期中纤毛器原基的发生与决定

应用扫描电镜和蛋白银染色对冠突伪尾柱虫有性周期中第一和第二次皮膜改组时新纤毛器原基的发生、定向和定位进行了观察。

冠突伪尾柱虫前仔虫口围带小膜数的调节

冠突伪尾柱虫无性分裂时，前仔虫的口围带由新旧小膜拼合而成。

冠突伪尾柱虫接合生殖DNA，RNA和蛋白质的合成

利用放射自显影术对冠突伪尾柱虫接合生殖期间其体内大分子合成进行研究，结果表明，接合体内除第二次成熟分裂外，其它各次核分裂之前都须进行一次ＤＮＡ合成．在大核原基发育过程中，其ＤＮＡ合成明显分为前后两个阶段．在接合体的老大核内持续进行低度的ＲＮＡ合成，并于接合后体分离时突然终止．４ｄ以后，数枚新的大核才出现活跃的转录．第二次皮膜改组启动之前，细胞内的蛋白质合成速率较低，其后显著增强．早期合成的ＲＮＡ以及蛋白质都参与了大核原基的发育．