Optimization of Pulsed-field Gel Electrophoresis Procedure for Bacillus cereus

In order to develop a rapid and reliable method for B. cereus genotyping, factors influencing PFGE results, including preparation of bacterial cells embedded in agarose, lysis of embedded cells, enzymatic digestion of intact genomic DNA, and electrophoresis parameters allowing for reproducible and meaningful DNA fragment separation, were controlled. Optimal cellular growth （Luria-Bertani agar plates for 12-18 h） and lysis conditions （4 h incubation with 500 μg/mL lysozyme） produced sharp bands on the gel.

脉冲场凝胶电泳在肠炎沙门菌食源性疾病溯源中的应用

目的对2006年广州地区食源性疾病中分离的肠炎沙门菌进行分子分型,探讨广州地区肠炎沙门菌的分子型别和多态性,为食源性疾病溯源及致病菌数据库的建立提供依据。方法采用限制性内切酶XbaI,对2006年分离到的菌株进行PFGE分子分型,使用BioNumericsVersion4.0软件(使用Dice系数和UPGMA法)对菌株进行聚类分析,并与深圳市的肠炎沙门菌PFGE型别进行比较。结果所有74株肠炎沙门菌均得到一致的PFGE克隆型,表明两次不同的食源性疾病均由同一PFGE型引起。广州与深圳的肠炎沙门菌PFGE图谱的比较表明,两地食源性疾病分离株具有很近的亲缘关系。结论PFGE分子分型与流行病学资料紧密结合可增强对肠炎沙门菌食源性疾病的溯源和预警。

脉冲场凝胶电泳技术及其在真菌学研究中的应用

脉冲电泳是用于分离大分子量DNA的一种电泳技术,已广泛用于真菌的核型分析,种群特异性鉴定,基因定位及遗传分析的研究。介绍了脉冲电泳的原理,发展和基本操作程序,并阐述了脉冲电泳技术在真菌分子生物学研究领域的应用。

根瘤菌参比菌株23S rRNA基因数量和定位及其系统发育群

为了明确23S rRNA基因数量和定位是否可更好地揭示根瘤菌参比菌株的系统发育关系,采用I-CeuI酶切和脉冲场凝胶电泳(PFGE)结合的方法,对根瘤菌株23S rRNA基因的数量和定位进行分析,并依据其相似性进行聚群.结果显示,根瘤菌参比菌株可聚为19个系统发育群.其中,在属的水平上,13个系统发育群与现行分类群(不包括依据16S rRNA基因序列分析结果)一致,6个不一致.在种的水平上,现行分类群中同种的根瘤菌可进一步细分为不同的系统发育群.这表明:I-CeuI酶切和PFGE结合的方法能从基因组特征角度对根瘤菌参比菌株进行更加细化的系统发育分类,并使其属种间的同质性更好.

江苏省1999—2005年霍乱弧菌的脉冲场凝胶电泳分析

目的了解江苏省1999-2005年间分离的霍乱弧菌核酸特征,及O139群与O1群霍乱弧菌在基因组水平上的关联。方法 NotⅠ酶切霍乱弧菌基因组,脉冲场凝胶电泳(PFGE)得到指纹图谱,并进行比较分析。结果 PFGE指纹图谱将全部136株霍乱弧菌分为6类,PFGE-A型由1株临床来源El Tor、120株临床来源和9株环境来源的O139组成,PFGE-B型由1株临床来源的El Tor组成,PFGE-C型由1株临床来源的El Tor和1株临床来源的O139组成,PFGE-D型由1株环境来源的El Tor组成,PFGE-E型由1株环境来源的O139组成,PFGE-F型由1株临床来源的O139组成。结论PFGE指纹图谱提示O139起源于不同克隆的El Tor霍乱弧菌,为了解O139的进化路线和流行规律提供了有效证据。作为高分辨率的基因分型工具,PFGE可用于追踪霍乱弧菌的暴发流行传染源,并在其分子流行病学研究中发挥重要作用。

宁夏志贺菌病原学特征分析

目的探讨宁夏地区志贺菌菌群分布、药物敏感性情况,并通过同源性分析研究其分子流行病学特征,为菌痢防控提供依据。方法通过系统生化条(API20E)鉴别菌株,用血清玻片凝集鉴定菌型,采用K-B法检测分离菌株对10种常用抗生素的敏感性,并应用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)进行分子分型,所得结果用BioNumericsV4.0软件UPGMA方法进行聚类分析。结果 176株志贺菌中,福氏志贺菌112株,占63.64%,其中福氏2b型52株,占29.55%;宋内志贺氏菌64株,占36.36%。药敏试验显示耐药率最高的药物为氨苄西林、萘啶酸、四环素、利福平;其次为阿莫西林、复方新诺明;而敏感性最高药物依次为环丙沙星(CIP)、头孢噻肟和头孢噻吩,其中福氏志贺菌和宋内志贺菌对10种抗生素的耐药谱略显不同;112株福氏志贺菌共分为36个带型,其中,JZXN11.NX06、JZXN11.NX07、JZXN11.NX021、JZXN11.NX0025占所有分型菌株的57.14%,为我省主要的暴发型。64株宋内志贺菌分为21个带型,J16X01.NX0011和J16X01.NX0012为两个主要流行带型,分别占分型菌株的31.25%和15.63%。结论本省志贺菌流行以福氏为主,其中F2b为优势菌型,F4c和宋内氏菌检出率显著增高;志贺菌对氨苄西林(AMP)、四环素(Te)、阿莫西林(AML)和萘啶酸耐药率最高,多重耐药现象严重;PFGE型别呈现多元化流行特点,流行的优势带型减弱、多种型别并存的复杂形态。

《中国药典》中标准菌种质控新方法的研究

目的 研究《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)纳入的标准菌种质控新方法,并评价不同批号标准菌种的质量稳定性。方法 对脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术进行比较研究,同时整合16SrRNA基因序列分析、多位点序列分型和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等质控新方法,进行标准菌种质控新方法的建立,并对标准菌种的质量进行评价。结果 形成了适用于《中国药典》中标准菌种的方法,并通过整合的质控新方法对不同批号的标准菌种进行评价,结果显示,菌种质量稳定,遗传信息无改变。同时,建立了标准菌种16SrRNA基因标准序列、PFGE标准指纹图谱和标准基因型。结论 标准菌种质控新方法的研究,为更加全面、深入地评价标准菌种的质量提供了依据;建立的标准菌种质量控制体系及标准菌种质控鉴定信息,为标准菌种持续的质量控制奠定了重要的参比信息基础。

江苏省肠出血性大肠杆菌O157:H7PFGE分子分型研究

目的:对我省历年分离的不同地区和来源EHEC O157:H7菌株之间的同源性进行分析。方法:用限制性内切酶XbaI,对分离菌株进行PFGE分型,并使用BioNumerics Version 4.0软件(Dice系数和UPGMA法)进行聚类分析。结果:74株O157:H7分离株可分为39个型,同一年份同一地区不同来源菌株之间有相同的XbaI酶切带型,同一年份不同地区分离菌株之间有相同酶切带型,不同年份部分菌株之间酶切带型不可区分。结论:我省宿主动物携带多个O157:H7克隆,来自同一个克隆的O157:H7已在较广泛的区域内传播,某些在1999年暴发流行的克隆长期稳定存在于我省宿主动物中,并传播给人类。

福建省50株沙门菌PFGE指纹图谱研究

目的分析福建省鼠伤寒及肠炎沙门菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)指纹图谱,研究其分型特征。方法收集2009年50株沙门菌临床分离株,其中30株鼠伤寒沙门菌分离自婴幼儿腹泻患者,20株肠炎沙门菌分离自感染性腹泻患者。选择XbaⅠ酶对沙门菌染色体DNA进行酶切,H9812作为脉冲场凝胶分子量标准。采用PFGE技术分析电泳酶切指纹图谱,运用BioNumerics软件进行聚类分析。结果 30株婴幼儿腹泻鼠伤寒沙门菌PFGE图谱按照100%的相似度可分为19个PFGE型,P1(Typhi)型有8株,P12(Typhi)型3株,P1(Typhi)为优势型别;20株肠炎沙门菌PFGE图谱按照100%的相似度可分为10个PFGE型,其中P1(Enteri)型6株,P4(Enteri)型有4株,P6(Enteri)型3株,P1(Enteri)型为优势型别。结论 PFGE分型方法分辨率高,重复性好,可广泛运用于沙门菌疫情溯源和早期防控。

应用PFGE分析广州稻叶型霍乱弧菌的同源性

目的分析广州40株稻叶型霍乱弧菌的毒力基因和PFGE特征,探讨菌株的同源性和广州稻叶型霍乱弧菌流行的特点。方法应用PCR方法检测稻叶型菌株的4种毒力基因,采用限制性内切酶NotI对菌株进行PFGE分型,使用BioNumerics Version4.0软件(复选Dice相关系数和UPGMA方法)对菌株进行聚类和同源分析。结果绝大多数水型稻叶霍乱疫情相关菌株为genotypeA型菌,而绝大多数环境分离稻叶型霍乱弧菌为genotypeB型和C型菌。40株霍乱菌株分布于18种pulsotype,水型霍乱疫情相关菌株的pulsotype极为相近(相似性系数98%以上),而环境分离的稻叶型霍乱弧菌呈现明显的pulsotype多样性。结论是否携带ctxA基因是稻叶型霍乱弧菌人源分离株与环境分离株的主要区别之一,绝大多数环境分离的稻叶型霍乱弧菌与人源分离株的同源性较低,但仍需加强对不同来源菌株的同源性分析和溯源追踪。

PFGE分子分型法在副溶血弧菌腹泻散发病人中的应用研究

目的:运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对腹泻门诊病人的副溶血弧菌分离株进行分子分型,对缺乏聚集性信息的病例开展实验室监测。方法:对2010年7月27日至29日分离到的40株副溶血弧菌进行PFGE分子分型,利用BioNu-merics分析软件对图谱进行聚类分析。结果:40株副溶血弧菌PFGE指纹图谱可分为16个PFGE型(P1-P16),其中有6个型别分别有多株菌株处于同一聚类(P1、P2、P3、P8、P10、P13),结果显示在不同的腹泻监测点该时段可能存在多起聚集性病例。结论:应用PFGE分子分型,通过实验室监测可提示可能出现聚集性病例或暴发,结合流行病学调查资料可分析和确诊聚集性病例事件发生。

脉冲场凝胶电泳技术对一起副溶血性弧菌引起的食物中毒的分型研究

目的：运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对一起由副溶血性弧菌引起的食物中毒所分离的菌株进行同源性分析。方法：对分离的副溶血性弧菌进行常规鉴定、血清分型后，进行PFGE分析并确定分子分型，用BioNumerics软件对PFGE分型图谱进行电子化数据分析，绘出聚类分析图，观察引起食物中毒的菌型是否为同一分子分型的菌株引起。结果：此次食物中毒分离到11株副溶血性弧菌，其中从病人粪便中分离10株，刀具涂抹物中分离1株，血清型均为03：K6型，这些菌株经PFGE聚类分析得到3种带型，3型之间分别有1—2条电泳条带的差异，相似性百分比为93％。结论：此次食物中毒是由同一克隆副溶血性弧菌引起，凝胶电泳技术适用于菌株的同源性的分析和传染源的追踪。

不同来源肠炎沙门菌的溯源研究

目的:应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对不同来源的肠炎沙门菌进行分子分型,为政府部门修订相关的卫生法规提供了重要科学依据。方法:采用限制性内切酶Xba I,对广州地区2009-2011年间从业人员健康体检和食物中毒中检出的36株肠炎沙门菌进行PFGE分子分型,用BioNumerics Version 4.0软件(复选Dice相关系数和UPGMA方法)进行聚类分析。结果:36株肠炎沙门菌PFGE图谱显示菌株之间密切相关,相似度在88.8%～100%。结论:从业人员健康体检和食物中毒分离的肠炎沙门菌菌株之间存在较高分子水平的同源性,提示健康带菌从业人员是沙门菌食物中毒不可忽视的污染源。

上海市奉贤区188株沙门菌分子分型研究

目的运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术研究上海市奉贤地区沙门菌的分子流行病学特征,为沙门菌病的鉴定溯源及防控预警提供技术支持和数据参考。方法对2012-2016年分离到的188株沙门菌进行PFGE分子分型,运用Bio Numerics V7. 6软件的UPGMA方法进行聚类分析。结果 80株鼠伤寒沙门菌分为57种PFGE带型,菌株间条带相似度为43. 6%～100. 0%,其中52株可分为4组大的克隆系,克隆系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中既有患者株也有食品株; 75株肠炎沙门菌分为38种PFGE带型,菌株间条带相似度为54. 4%～100. 0%,其中62株为1组大的克隆系,58株为患者株,4株为食品株;33株伦敦沙门菌分为28种PFGE带型,菌株间条带相似度为50. 1%～100. 0%,其中22株可分为3组大的克隆系,克隆系Ⅰ、Ⅱ中既有患者株也有食品株。结论 PFGE分型结果反映了本区鼠伤寒、肠炎、伦敦沙门菌PFGE型别的多样同时具有优势克隆系,而且各优势克隆系有稳定的遗传持久性。奉贤区沙门菌病例与食用污染的生鲜肉制品有密切关系,PFGE分子分型技术在致病菌的传播、追踪和溯源方面更具有针对性。

中国钩端螺旋体疫苗生产用菌种罗株分子遗传特性分析

目的：分析研究中国钩端螺旋体疫苗生产用菌种罗株的分子遗传特性,为钩体疫苗生产用菌种分子遗传质量控制方法的研究奠定基础。方法：通过对罗株16S rRNA基因片段进行PCR扩增、测序,并运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分析（MLST）等方法,对其进行分子分型。结果：16S rRNA基因序列比对结果显示钩体疫苗生产用菌种罗株基因种为致病性问号型;PFGE分析结果表明该疫苗株全基因组在酶切后共有100～1 000 kb大小不等的片段11个,与我国其他不同血清群代表株酶切片段的数量、大小和分布特征方面明显不同;多位点序列分析得出该罗株序列型为140。结论：本文对钩体疫苗生产用菌种罗株的分子遗传信息分析结果,可为后续的钩体疫苗生产用菌种分子遗传质量控制方法的研究提供参考。

深圳市龙岗区肠炎沙门菌散发腹泻病例的分子流行病学分析

目的调查分析2010年-2012年深圳市龙岗区腹泻病人肠炎沙门菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型及耐药情况,从散发病例中发现潜在的暴发病例。方法对分离的肠炎沙门菌进行PFGE分子分型和耐药试验,对其中一组分离出PFGE型相同菌株的病例进行后续的流行病学调查。结果 47株肠炎沙门菌Xba I酶切指纹图谱可分为18个PFGE型,双酶切结果显示同一PFGE型菌株耐药情况相同或相似,且有多组所对应病例有较强的时空聚集性,部分病例经流行病学调查后证实有共同暴露。结论深圳市龙岗区肠炎沙门菌来源复杂,部分散发株来自食物中毒暴发事件。

脉冲场凝胶电泳分型应用于奇异变形杆菌食源性疾病的溯源

目的:应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对奇异变形杆菌食源性疾病进行分析。方法:采用限制性内切酶Sfi I,对广州市二起疑似奇异变形杆菌食源性疾病中22株奇异变形杆菌进行PFGE分子分型,用BioNumerics Version 4.0软件(复选Dice相关系数和UPGMA方法)进行聚类分析。结果:以80%相似度为标准,22株奇异变形杆菌被分成7个PFGE克隆型。同起食源性疾病菌株克隆型相似度较高,不同起食源性疾病菌株克隆型有交叉但存在较大差异。结论:PFGE分子分型与流行病学资料紧密结合可增强对变形杆菌食源性疾病的溯源和预警。

广州地区小川型霍乱弧菌的脉冲场凝胶电泳分析

目的分析小川型霍乱弧菌的致病相关基因型,探讨广州地区小川型霍乱流行趋势和规律。方法采用多重PCR方法检测小川型菌株的4种致病相关基因,应用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对菌株进行分子分型,对PFGE图谱采用分子分型软件BioNumerics Version 4.0进行聚类分析。结果广州地区小川型菌株中存在3种致病相关基因型,即A型、B型和C型,20%感染者分离株为致病相关基因A型,80%环境分离株为致病相关基因C型。25株霍乱弧菌分为14个不同的PFGE型,归为3个聚类群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群)。每一次小川型暴发中分离的菌株PFGE克隆型相同或相近,而散发病例分离株与暴发株的PFGE型有些相同,有的差异较大。环境小川型菌株中存在PFGE克隆型的多样性,部分环境株与感染者分离株具有相近的PFGE型。结论应建立广州地区霍乱菌株的PFGE分子分型数据库,加强霍乱的预防、控制和预警。

一起鼠伤寒沙门菌食物中毒的病原学检测与溯源分析

目的对一起由鼠伤寒沙门菌引起的食物中毒进行病原学检测与溯源分析。方法将采集的样本先用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-PCR)进行初步检测,然后按常规进行病原菌的分离培养、生化鉴定、血清型分型和药敏试验,用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)对分离出的沙门菌菌株进行同源性分析。结果11份肛拭子样本中有5份检出鼠伤寒沙门菌,5份食品样本中有2份检出鼠伤寒沙门菌,7株鼠伤寒沙门菌均对头孢唑林、头孢替坦、阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素耐药,其中有5株对呋喃妥因中度敏感。运用PFGE对分离到的鼠伤寒沙门菌进行分子分型,其图谱相似性系数为85.29%~100.00%。结论本次食物中毒是由进食被鼠伤寒沙门菌污染的皮蛋和炒小瓜所致,通过PFGE对致病菌进行溯源,追踪菌株的来源,PFGE能有效应用于食物中毒溯源分析。

注射剂科氏葡萄球菌污染的鉴定和同源性分析方法研究

目的:采用多种常用微生物鉴定方法和同源性分析方法,对某制药企业注射剂无菌检查试验中分离的微生物污染菌A1进行来源分析,为药品生产企业完善微生物监控体系,实现生产和检验过程的微生物控制提供技术参考。方法:使用VITEK 2微生物生化鉴定仪对A1和本次污染调查采集的78株菌进行初步鉴定,选择与A1同属的菌,分别采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、16S rRNA基因序列分析、核糖体分型(Ribotyping)、全基因组测序(WGS)等方法进行鉴定和同源性分析,同源性分析结果用PFGE进行了验证。结果:除MALDI-TOF MS法的部分鉴定结果外,几种方法的微生物鉴定结果完全相同;上述方法的同源性分析结果均为A1溯源自无菌检验使用的无菌隔离器内部仪器表面采集菌株A2(16S rRNA基因序列分析本次仅溯源至亚种),该结果得到了PFGE证实;不同方法在种的集群之间的亲缘关系划分有所不同。结论:微生物污染溯源的流程一般包括以下3步:首先采用生化鉴定法初步确定污染菌的种;其次从污染调查采集菌株和环境菌库中选择与污染菌同种的微生物;然后,使用16S rRNA基因序列分析、核糖体分型、全基因组测序等方法进行微生物鉴定和同源性分析。采用16S rRNA基因序列分析时,必须进行多相鉴定以便准确溯源,才能有效实施纠正与预防措施。