高效液相色谱法对绿脓菌素的表达分析

目的 采用高效液相色谱法建立铜绿假单胞菌代谢物绿脓菌素测定方法,并对绿脓菌素含量表达进行分析。方法 采用Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱分离,柱温40℃,流速为1.0 mL/min,进样量20μL,流动相为0.01%甲酸水—乙腈梯度洗脱,检测波长为268 nm。结果 绿脓菌素在0.20~10.00μg/mL范围内线性关系良好;绿脓菌素方法检出限为0.10μg/mL,方法定量限为0.20μg/mL;在0.22~0.66μg/mL和1.10~3.30μg/mL的添加范围内,绿脓菌素的回收率(n=3)为94.85%~113.67%,方法精密度(RSD)小于0.61%。通过该方法初步测定,发现较低浓度左氧氟沙星对铜绿假单胞菌分泌绿脓菌素起促进作用,可能与其耐药机制有关。结论 该方法简便、准确,精密度和回收率良好,可用于绿脓菌素的检测,对进一步研究铜绿假单胞菌耐药机制和绿脓菌素分泌量的关系具有一定的指导意义。

绿脓菌素产量优化及其降解含氮化合物

为探究细菌胞外分泌物对含氮化合物降解能力的影响,以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产生的PYO(绿脓菌素)为研究对象,进行单因素试验及运用RSM(响应曲面法)的统计学模型以优化PYO产量,电化学测试探讨PYO降解的影响机理,并将其用于含氮化合物的降解。结果表明:对PYO生成有显著影响的3种因素有C/N元素质量比、pH值和Mg^(2+)质量浓度,经过方差分析和评估得到最佳条件:C/N比为24,pH值为7.9,Mg^(2+)质量浓度0.96 g/L,此时PYO产量为10.74 mg/L。电化学测试说明降解率的提升得益于PYO的氧化还原性。将PYO用于含氮化合物中,TOC(总有机碳)和TN(总氮)降解率达到75%、92%,说明PYO可促进吲哚、吡啶的降解,可为PYO用于废水处理研究提供参考。

绿脓菌素抑制缺铁环境中铜绿假单胞菌的生长代谢

为了探究铁离子对铜绿假单胞菌(PA)的影响,在缺铁及加铁条件下探究PA绿脓杆菌(PAO1)的生长状态,结果发现缺铁离子限制PAO1的生长.利用蛋白质组学质谱技术检测PAO1在不同铁离子条件下的蛋白表达差异,结果表明与合成绿脓菌素相关的吩嗪类蛋白在缺铁条件下表达量发生显著上调;定量检测结果验证PAO1在缺铁环境中产生绿脓菌素的量相较于加铁环境显著增加;通过检测外源加入的绿脓菌素对PAO1在缺铁及加铁条件下生长状态的影响,表明绿脓菌素会导致PAO1在生长初期生长缓慢且在生长中期菌体密度显著下降. PA生长状态的变化可能是由于缺铁条件下PAO1产生的绿脓菌素对其自身的杀伤作用所致.

Characterization,application and statistical optimization approach for enhanced production of pyocyanin pigment by Pseudomonas aeruginosa DN9

The aim of this work was to study the pyocyanin pigment from Pseudomonas aeruginosa DN9.The work involves optimiza-tion of process parameters for enhanced production of pyocyanin pigment under submerged fermentation condition.During optimization process,maximum pyocyanin production(92.12μg/ml)was obtained with carbon source mannitole,nitrogen source peptone,inorganic salt NaCl and metal ion FeSO_(4).Plackett Burman design and Response Surface Methodology(RSM)showed peptone,NaCl and KH_(2)PO_(4)are significant variable in the production of pyocyanin pigment.The FTIR and GC-MS study was done to evaluate structural properties of pyocyanin pigment.The purified pigment was further analyzed as colouring agent and for inhibitory action against pathogenic microorganisms.Thus,present study showed Pseudomonas aeruginosa DN9 as promising culture for pigment production with potential biotechnological application.

左氧氟沙星联合芪归银方对铜绿假单胞菌生物膜和绿脓菌素的影响

目的基于中药提取物和含药血清两个层次研究左氧氟沙星(LEV)联合芪归银方(QGYD)对铜绿假单胞菌标准菌株及耐药菌株生物膜和绿脓菌素的影响,为中药联合抗菌药物防治生物膜感染的临床用药提供参考。方法制备药液(LEV组、LEV+QGYD组)和LEV组、LEV+QGYD组系列含药血清,分别干预铜绿假单胞菌标准菌株和临床多重耐药菌株,测定铜绿假单胞菌生长量、生物膜形成量和绿脓菌素分泌量。测定LEV组、LEV+QGYD组含药血清中LEV的含量和各组大鼠血清中TNF-α和IL-2的水平。结果LEV组和LEV+QGYD组(药液/血清)均能抑制铜绿假单胞菌(标准/耐药)的生长、生物膜的形成和绿脓菌素的分泌;LEV组与LEV+QGYD组血清中LEV含量分别为6.14μg·mL^(-1)和5.12μg·mL^(-1)。与空白对照组相比,LEV组TNF-α表达水平明显升高,IL-2表达水平无明显变化;QGYD组、QGYD+LEV组TNF-α和IL-2均无明显变化。与LEV组相比,QGYD+LEV组TNF-α和IL-2表达水平均明显降低。结论体外和半体内研究均表明,联用QGYD能增强LEV的抗菌活性,有效抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成和绿脓菌素的分泌。

喹诺酮信号分子对lasR缺陷型铜绿假单胞菌绿脓菌素活性的影响

目的:通过与群体感应(Quorum Sensing,QS)基因正常菌株对比,探讨喹诺酮信号分子对lasR缺陷型铜绿假单胞菌绿脓菌素活性的影响。方法:选取2021年3月至2022年10月山西医科大学第二医院临床分离的10株铜绿假单胞菌为研究对象,QS基因正常的非重复菌株为正常组,只有lasR基因缺失的为缺陷组,观察正常组和缺陷组经不同浓度喹诺酮信号分子(Pseudomonas Quinolone Signal,PQS)(10μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)和不同时间(1 d、2 d、3 d、4 d和5 d)诱导绿脓菌素活性的变化,采用秩和检验和重复测量方差分析进行结果分析。结果:诱导前缺陷组的绿脓菌素活性低于正常组,两组的绿脓菌素活性差异有统计学意义(P <0.05)。组内比较表明,不考虑诱导浓度间的差异,正常组菌株在不同诱导时间的绿脓菌素活性差异有统计学意义(P <0.05),缺陷组活性差异没有统计学意义(P> 0.05);不考虑诱导时间之间的差异,正常组在不同诱导浓度下的绿脓菌素活性差异有统计学意义(P <0.05),缺陷组活性差异没有统计学意义(P> 0.05)。组间比较表明,两组菌株在不同诱导时间和诱导浓度下绿脓菌素活性差异均有统计学意义(P <0.05)。结论:外源性喹诺酮信号分子不同诱导方案对正常组和缺陷组绿脓菌素活性影响不同,正常组在不同诱导方案下绿脓菌素活性不同程度地提高,缺陷组在不同诱导方案下绿脓菌素活性变化不明显,缺陷组的绿脓菌素活性均低于正常组。

黄芪对铜绿假单胞菌毒力因子调控表达及菌体运动的影响

[目的]观察黄芪对铜绿假单胞菌相关毒力因子表达及菌体运动的影响,探讨黄芪对铜绿假单胞菌的作用机制。[方法]不同浓度黄芪与对数生长期铜绿假单胞菌共培养,弹性蛋白-刚果红降解实验检测细菌分泌的弹性蛋白酶活性,紫外分光光度法测定绿脓菌素分泌量,结晶紫染色法观察生物被膜形成量,在含黄芪琼脂平板中检测菌体集群运动与泳动能力。[结果]黄芪在终浓度25、12.5、6.25 g/L条件下对弹性蛋白酶、绿脓菌素表达有显著抑制,并能抑制生物被膜形成。在低于12.5 g/L时对细菌增殖无显著影响。细菌在12.5 g/L条件下泳动能力与集群运动均受到显著影响。[结论]黄芪对铜绿假单胞菌增殖和毒力因子表达的抑制程度不一致,提示黄芪抑菌可能通过多种途径发挥抑菌功能,并可能在低浓度下便对密度感应系统造成显著抑制。

铜绿假单胞菌对致病真菌的抑制作用

目的观察临床分离的24株铜绿假单胞菌(PA)对致病性真菌(如白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌等)的抑制作用。方法收集临床上24株PA,通过革兰染色、氧化酶试验及API 20NE(法国梅里埃公司产品)进行鉴定;通过纸片法、十字交叉划线法及共培养检测PA对致病性真菌的抑制作用。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对有抑制作用的PA和无抑制作用的PA分泌蛋白进行电泳。结果 24株PA中部分菌株对常见的致病性真菌有显著抑制作用,而部分PA菌株有一定抑制作用,另外一些完全没有抑制作用;共孵育试验显示PA可能是通过抑制真菌的菌丝生长而产生抑制作用。SDS-PAGE显示有抑制作用的PA和无抑制作用的PA分泌物蛋白间存在明显差异。结论PA对常见的致病真菌具有抑制作用,推测可能与抑制真菌的菌丝生长及分泌抑制真菌生长的各种蛋白类物质有关。

细菌产绿脓菌素对东海原甲藻生长的影响

以东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)为实验材料,研究了铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)产绿脓菌素对藻细胞生长的影响。结果表明,当其浓度达到5.0mg.L-1时,对东海原甲藻的生长表现出明显的抑制效果,并且抑制效果随浓度的增加而增强。对裸甲藻而言,当其浓度增加至15.0mg.L-1时,裸甲藻的生长才开始受到较明显的抑制。8.0和15.0mg.L-1的绿脓菌素在实验初期对湛江叉鞭金藻的生长表现出了一定的抑制作用,但这种抑制作用不能持久。对绿藻而言,即使浓度增加至15.0mg.L-1,绿藻的生长受其影响也很弱。本文首次探讨了细菌产绿脓菌素对东海原甲藻的抑制作用,结果表明该类物质可以选择性的抑制东海原甲藻的生长。

铜绿假单胞菌色素代谢相关基因的研究

首次应用Mu转座重组技术研究铜绿假单胞菌色素合成与调控的机制。通过一系列的表型筛选 ,得到 8株色素合成能力改变的突变子。经基因克隆、核苷酸测序研究 ,证明转座子分别插入到hmgA、ptsP、sucC、phzS、phzF1五个基因中。hmgA基因转座失活导致酪氨酸分解代谢中间产物尿黑酸的积累 ,后四种情况转座突变显著地影响了铜绿假单胞菌最重要的色素 绿脓素 (pyocyanin)的合成 ,其中PhzS和phzF1是绿脓素合成过程中的结构基因 ,ptsP基因是 1个磷酸转移酶系统的重要组分 ,sucC基因的产物是三羧酸循环中的琥珀酰辅酶A合成酶 。

对氧磷酶1对铜绿假单胞菌绿脓素生成及其细胞氧化损伤的影响

目的研究对氧磷酶1(PON1)在铜绿假单胞菌绿脓素生成及绿脓素所致细胞损伤中的作用,探讨其在防治肺部铜绿假单胞菌感染方面的可能作用。方法①以293细胞为表达细胞,分为pcDNA 3.1(+)-PON1转染组、pcD-NA3.1(+)-EGFP转染组及生理盐水组,转染细胞后,将细胞蛋白提取物或生理盐水混入铜绿假单胞菌培养物中,过夜培养后检测培养物中密度感知系统信号分子——酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)及绿脓素水平。②以A549细胞为效应细胞,分为转染组、未转染组及生理盐水组。转染组采用pcDNA3.1(+)-PON1转染A549细胞后并经G418筛选的阳性克隆细胞,未转染组采用普通A549细胞,培养液中加入绿脓素(30μg/ml),生理盐水组为培养液中加入生理盐水的普通A549细胞,观察细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。结果①pcDNA3.1(+)-PON1转染组铜绿假单胞菌培养物中AHL信号分子水平和绿脓素水平较生理盐水组和pcDNA3.1(+)-EGFP转染组均明显降低;②绿脓素作用后,未转染组细胞内氧化应激水平较生理盐水组明显升高,而转染组较未转染组有所下降。结论PON1不仅能够减少铜绿假单胞菌绿脓素的生成,而且可以减轻绿脓素所致的细胞氧化损伤,可能具有防治铜绿假单胞菌感染的潜在价值。

水样中绿脓杆菌产色素的初步研究

绿脓杆菌能产生包括绿脓素在内的多种色素[1],色素产生受多种因素的影响。培养基的不同,绿脓杆菌色素生成也不同,现对2010年水样中所监测到的绿脓杆菌在不同培养基上所产生的色素进行分析,发现镁离子与甘油在一定浓度下对其色素生成促进效果最好。通过对培养基中影响绿脓杆菌色素产生的影响因素了解,有利于水中绿脓杆菌色素差异菌株的检测。

绿脓菌素通过PKC-NF-κB信号传导通路诱导人NCI-H292细胞表达IL-8

目的探讨绿脓菌素（PCN）对人气道上皮细胞株（NCI-H292细胞）表达IL-8的诱导作用及通过蛋白激酶C（PKC）和核因子κB（NF-κB）的调控机制。方法采用ELISA法对PCN诱导NCI-H292细胞分泌IL_8进行分析，应用Western blot检测NF-κB的蛋白表达，观察PKC和NF-κB阻断剂对IL-8表达的影响。结果PCN可促进NCI-H292细胞IL-8的分泌，而且具有明显的量效关系。PKC阻断剂钙感光蛋白（Cal C）及NF-κB阻断剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）均能抑制IL-8的表达（P〈0．01）。PCN能直接诱导并迅速活化NF-κB，60～90min表达明显。结论PCN可能通过PKC信号通路促进NF-κB的活化，从而启动IL-8的高效表达。

绿脓杆菌阳极的微生物燃料电池含溶解氧性能研究

本文研究了绿脓杆菌分泌的电子中介体绿脓菌素与电极之间的反应,并探讨了溶解氧的影响.通过循环伏安曲线、测试电极开路电位等方法,确定绿脓菌素阳极反应是受扩散控制的可逆反应.菌液的溶解氧浓度在一定范围内（0~1.6 mg·L-1）对绿脓菌素和电极之间的反应影响不大.微生物燃料电池的极化曲线表明,当溶解氧为1.6mg·L-1时,微生物燃料电池输出电流下降了7%,对绿脓杆菌阳极的微生物燃料电池影响不大.

绿脓菌素激活MAPKs、NF-κB信号通路诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达

采用绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素刺激人呼吸道上皮细胞株A5 4 9和SPC A 1,用ELISA方法检测细胞IL 8分泌水平 ,并使用免疫印迹 (Westernblot)方法观察绿脓菌素对细胞内重要的炎症信号传导途径NF κB及丝裂原激活蛋白激酶 (MAPKs)的激活作用。实验发现 ,绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素可诱导呼吸道上皮细胞株IL 8分泌增加 ,且具有剂量依赖效应。绿脓菌素刺激细胞可使细胞内IκB α发生降解 ,同时使MAPK家族蛋白分子 (ERK1 2、p38、JNK)发生磷酸化。MEK1 2 (ERK1 2激酶 )抑制剂U0 12 6 (10 μmol L)和p38MAPK抑制剂SB2 0 35 80 (10 μmol L)可降低绿脓菌素诱导A5 4 9细胞IL 8的合成。以上结果显示绿脓菌素通过MAPK信号传导通路增强呼吸道上皮细胞IL 8的表达 ;NF κB通路也参与了绿脓菌素调控细胞IL

N-乙酰半胱氨酸对铜绿假单胞菌的耐药性及绿脓菌素产量的影响

铜绿假单胞菌（ pseudomonas aeruginosa ）是院内感染的主要病原菌之一,具有很强的耐药性。其产生的次级代谢产物绿脓菌素（ pyocyanin,PCN）,可改变细胞内氧化还原水平,对宿主造成氧化伤害,是导致铜绿假单胞菌感染病人死亡的主要原因之一[1-3]。 N-乙酰半胱氨酸（ N-acetylcysteine, NAC）是一种含有巯基的小分子化合物,常被作为抗氧化剂,用来改善细胞内氧化还原水平[2,4],因此在一些临床实验中,NAC被用来治疗铜绿假单胞菌感染性疾病。但是,从目前已有的研究可以看出, NAC是否有助于铜绿假单胞菌感染性疾病的治疗还没有一致的观点,具体机制也并不清楚。在本研究中,为了进一步明晰NAC与铜绿假单胞菌感染性疾病的关系,我们研究了NAC与铜绿假单胞菌的耐药性和毒性分泌关系。

脓青素对光抑制条件下菠菜叶绿体的保护作用

在有氧条件下，脓青素可以缓解强光对菠菜叶绿体电子传递的抑制作用。加入解联剂尼日利亚菌素消除跨膜质子梯度会加剧叶绿体的光抑制，但脓青素的保护作用并不消失。脓青素对光系统Ⅰ与光系统Ⅱ均表现出保护作用，但对ＰＳⅡ的保护在光抑制初期较明显；在厌氧条件下，脓青素加剧叶绿体的光抑制，引起ＤＣＩＰ光还原与水到ｐ－ＢＱ电子传递活力的降低。推测脓青素可能通过促进细胞色素ｂ５５９介导的ＰＳⅡ循环电子传递，减轻了叶绿体的光抑制。

S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸对绿脓菌素感染所致靶器官损伤以及氧化应激的调节作用

目的:研究S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸对绿脓菌素感染所致靶器官损伤以及氧化应激的调节作用。方法:将成年雄性SD大鼠随机分为对照组、NaCl组以及SNAC组,NaCl组和SNAC组均进行气管内绿脓菌素接种,SNAC组给予S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸腹腔注射治疗。比较3组大鼠血清中炎症介质含量以及肺脏组织中凋亡细胞数目、NO含量、氧化反应产物含量、内质网应激标志分子表达量。结果:NaCl组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量以及肺脏组织中凋亡细胞的数目均明显高于对照组,SNAC组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量以及肺脏组织中凋亡细胞的数目均低于NaCl组;NaCl组大鼠肺脏组织中NO的含量均低于对照组,SNAC组大鼠肺脏组织中NO的含量高于NaCl组;NaCl组大鼠肺脏组织中MDA、AOPP、8-OhdG、GRP78的含量均高于对照组,SNAC组大鼠肺脏组织中MDA、AOPP、8-OhdG、GRP78的含量均低于NaCl组。结论:S-亚硝基-N-乙酰半胱氨酸能保护绿脓菌素感染所致肺脏损伤,缓解炎症反应、抑制细胞凋亡、减轻氧化应激反应。

金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分离鉴定中的体会

目的从上级单位质控考核样本中分离金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。方法按《消毒技术规范》2002年版对质控样本进行增菌、分离和鉴定。结果菌落特征:盲样样本在血平皿上呈白色并具有溶血环菌落,在十六烷三甲基溴化铵琼脂平皿上呈灰白色边缘不整齐菌落。形态染色结果:盲样样本中白色有溶血环、微凸起、边缘整齐的菌落和ATCC6538及ATCC12228为革兰阳性(G+)葡萄状球菌,盲样样本中白色有溶血环,扁平、边缘不整齐菌落和ATCC90278为革兰阴性(G-)无芽胞杆菌。将G+葡萄状球菌做金黄色葡萄球菌的生化鉴定,结果盲样样本和ATCC6538均为阳性,而ATCC12228只有H2O2酶试验和葡萄糖发酵试验为阳性;将G-无芽胞杆菌做铜绿假单胞菌的生化鉴定,结果盲样样本和ATCC90278的绿脓菌素在培养24 h为阴性,培养48 h为阳性,不能液化成品明胶和12%的明胶,能液化11%的明胶,能还原硝酸盐,42℃生长试验阳性。结论金黄色葡萄球菌在血平板上有时为白色菌落,色素只是判别金黄色葡萄球菌多个因素中的一个因素,检验人员不能仅根据色素做出判定,否则容易做出错误的结论;铜绿假单胞菌绿脓菌素试验24 h可能为阴性,必要时可以延长培养时间;在铜绿假单胞菌明胶液化试验中,要根据实际情况把握好明胶的浓度和菌种的接种量,否则会造成假阴性,对铜绿假单胞菌的判定造成困惑。

铜绿假单胞菌L型的诱导及其产绿脓菌素能力的研究

目的采用哌拉西林诱导铜绿假单胞菌变异为L型,并研究其L型产绿脓菌素的能力。方法采用平板纸片法和液体浓度梯度法,利用哌拉西林药物纸片诱导铜绿假单胞菌标准菌株变异为L型;通过绿脓菌素试验测定铜绿假单胞菌L型的绿脓菌素产生能力。结果铜绿假单胞菌L型可被哌拉西林诱导为L型,铜绿假单胞菌L型仍具有产生绿脓菌素的能力,但产生的速度较原菌慢且量少。结论铜绿假单胞菌L型为该菌存在的重要形式,其仍能产生绿脓菌素为其致病因素之一。