我国大麦条纹病菌(Pyrenophora graminea)群体遗传多样性AFLP分析

条纹病是重要的种传真菌病害之一,能对大麦生产造成严重产量损失。本研究利用AFLP方法对来自青海、河南等10省份大麦种植区的条纹病菌菌株进行遗传多样性分析,从分子水平上揭示我国不同大麦产区的条纹病菌群体遗传差异。结果显示,利用8对AFLP选择性引物组合对19份大麦条纹病菌进行了全基因组多态性扩增,共获得144条可统计的条带,其中112条具有多态性,多态性条带占77.8%。在相似系数为0.83时,可将19份大麦条纹病菌菌株划分为4个类群,多数菌株聚类在类群Ⅰ和类群Ⅱ中,类群Ⅲ和类群Ⅳ中仅各包含1个菌株,且与其他2个类群中的成员亲缘关系较远。因此,我国大麦条纹病菌群体中存在一定程度的遗传变异。另外,发现菌株间亲缘关系远近与其分布地域无明显规律。

大麦条纹病抗性鉴定及与SSR标记的关联分析

大麦条纹病是对大麦产量及品质影响最为严重的病害之一,为探明我国不同来源的大麦种质对条纹病的抗性差异并挖掘与大麦抗条纹病相关联的候选标记,本研究利用97个SSR标记对137份大麦品种进行遗传多样性及群体结构分析,并结合抗性鉴定结果进行关联分析。结果表明,人工接种大麦条纹病菌后共鉴定出18份免疫、27份高抗、28份中抗、42份中感和22份高感大麦材料;在97对SSR引物中挑选出85对多态性较好的引物,85对SSR标记共检测到651个等位变异,平均每个标记为7.57个;SSR标记的基因多样性指数变幅为0.0401~0.8646,平均值为0.5799;多态性信息含量变幅为0.0393~0.8498,平均值为0.5155,137份大麦材料的遗传距离范围为0.1021~0.4807,平均值为0.2774;聚类分析及群体遗传结构分析均将137份大麦种质分为4大类群;根据一般线性模型(GLM,general linear model)共获得7个与大麦抗条纹病显著关联的标记(P<0.05),解释率在5.80%~17.89%之间,其中标记EBmatc0039的解释率最高;标记EBmac77和MGB357与大麦条纹病抗性呈极显著相关(P<0.01),二者在一般线性模型中解释率分别为6.07%和9.60%。本研究结果可为大麦抗条纹病育种提供参考。

大麦条纹病菌基因Pgr 03902致病功能研究

为明确基因Pgr 03902(序列号:OP999070)是否参与调控大麦条纹病菌的致病性,为大麦条纹病菌致病机理的研究提供理论依据,本研究运用生物信息学、亚细胞定位和基因干扰技术初步研究了该基因功能。结果表明,Pgr 03902基因开放阅读框大小为348 bp,编码116个氨基酸,编码蛋白二级结构中无规则卷曲较多,编码蛋白具有酸性、不稳定性、亲水性、无信号肽结构等特性;亚细胞定位结果显示,Pgr 03902基因在细胞核和细胞膜上均有表达;采用PEG介导的原生质体转化法获得了1个干扰菌株ΔPgr 03902,RT-qPCR结果表明,ΔPgr 03902中Pgr 03902基因表达量较野生型菌株QWC下降了60.79%(P<0.05),对干扰菌株的营养生长、菌丝形态观察以及致病性研究结果显示,ΔPgr 03902生长速率和致病力均显著低于野生型菌株QWC(P<0.05)。以上结果表明,Pgr 03902参与该菌的生长发育和致病过程。本研究初步明确了Pgr 03902基因在大麦条纹病菌侵染过程中的功能,为进一步研究大麦条纹病菌与寄主之间互作奠定了基础。

甘肃省大麦条纹病菌遗传多样性及致病力差异

为了解甘肃省大麦条纹病病原菌Pyrenophora graminea的遗传多样性及致病力差异,运用RAPD分子标记技术对大麦条纹病菌不同菌株进行遗传多样性分析,并采用三明治法进行菌株致病力差异研究。结果表明:17个RAPD标记从45个菌株中扩增出126条带,平均每个标记7.41条带,遗传相似系数范围为0.468 3～0.984 1,平均值为0.830 8,当遗传相似系数为0.723 6时,可将供试菌株划分为4个类群,分别包含41、2、1和1个菌株;致病力测定结果显示菌株QWC较菌株QQ致病力强,两菌株除在品种‘甘啤2号’和‘GP-3’上无致病力外,在其他供试品种上致病力均存在差异。表明大麦条纹病菌不同菌株间存在遗传差异,且菌株QWC和菌株QQ存在致病力差异。

大麦条纹病病菌对大麦叶片防御酶活性的影响

为探究大麦对条纹病菌侵染的生理响应机制,以高感品种Alexis为试验材料,测定接种大麦条纹病病菌后0、3、6、9和12 d不同时间点的大麦叶片内防御酶及叶绿素相对含量的变化。结果表明:随着侵染时间的延长,超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量和过氧化氢酶的活性先上升后下降,与对照相比,平均增幅分别为27.58%、70.55%、32.71%;过氧化物酶在接种后第6天略有下降,但整体呈上升趋势,平均增幅为39.38%;丙二醛和叶绿素相对含量呈下降趋势,且均低于对照,平均降幅为11.21%、46.39%,病害越重,叶绿素下降的幅度越大,最大降幅为84.34%。综上所述,高感品种Alexis在不同时间段应答大麦条纹病病菌胁迫的生理生化反应不同。

大麦条纹病原菌的RAPD遗传多样性分析及大麦亲本抗性评价

为了明确大麦条纹病菌-麦类核菌(Pyrenophora graminea)在甘肃省河西走廊地区不同地理位置的遗传差异性,并鉴定大麦亲本品种对其抗性,运用RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术,对甘肃农业大学农学院麦类实验室保存的20个采自河西不同地区的大麦条纹病菌株进行遗传多样性分析,采用“夹心法”对30种大麦亲本材料进行抗性评价。结果表明,在遗传相似系数(GS)为0.7166时可将20个麦类核菌(P.graminea)菌株划分为4类,菌株XTB和JT聚为一类,且这2个菌株的地理位置相隔较远,菌株YC和HYH各自单独为一类,剩余16个菌株聚为一类;20个供试菌株中,菌株QQ和SW、菌株HZ和QWC的遗传相似系数(Genetic Similarity,GS)均为0.9365,遗传相似性最高,遗传距离值分别为0.0523和0.0455。菌株YC的遗传相似系数最小,为0.6241,与其他菌株间的遗传距离范围是0.3722~0.6330,得出不同地理来源的麦类核菌菌株存在一定的遗传差异性;在供试菌株中,菌株CJZ和SW的地理位置接近,遗传距离小,而菌株SW和QWC,HZZ和SW,SSB和HZ之间的地理位置均相隔较远,但两两之间的遗传距离值均较小,得出菌株间地理位置的远近差异与遗传距离的大小无显著相关性。抗性鉴定结果显示,30份供试的大麦亲本品种对菌株QWC的抗病性差异较大,鉴定出6份高感大麦条纹病品种,19份感病品种,5份抗病品种,其中‘Isotta’的抗性最差,‘甘啤6号’抗性最好。综上所述,引起甘肃河西走廊地区大麦条纹病的病原菌群体存在较高遗传差异性,且其亲缘关系的远近与地理差异无明显相关性;鉴定大麦亲本抗性,得到抗感大麦品种组合‘甘啤6号’和‘Isotta’。

青稞条纹病LAMP检测体系的建立

【目的】建立青稞条纹病的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测体系,为青稞种子带菌检测及其条纹病的有效防控提供参考。【方法】根据麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)的ITS-rDNA序列区间设计5组引物,从中筛选特异性引物,并通过设置60,61,62,63,64和65℃6个温度梯度来优化LAMP反应体系的温度,以建立高效检测麦类核腔菌的LAMP技术体系;分别以麦类核腔菌、大麦坚黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、细链格孢和禾谷镰孢菌基因组DNA为模板进行LAMP扩增反应,对该体系的特异性进行检测;以310,31,3.1,0.31,0.031和0.0031 pg/μL的麦类核腔菌基因组DNA为模板,对该体系的灵敏度进行分析;最后利用该体系对肚里黄、柴青1号、1141、北青9号和昆仑15等5个青稞主栽品种的种子带菌率进行检测。【结果】青稞条纹病LAMP检测体系的特异性引物为引物组2,最佳反应温度63℃,反应时间70 min;该检测体系对麦类核腔菌具有良好的特异性,其最低检测限为0.31 pg/μL;肚里黄、柴青1号、1141、北青9号和昆仑15种子的带菌率分别为68.18%,72.73%,100%,77.27%和68.18%。【结论】建立了青稞条纹病LAMP检测体系,该体系能在63℃、70 min内检测出青稞种子是否携带条纹病菌。

青海省青稞条纹病菌遗传多样性分析

青稞条纹病是由麦类核腔菌Pyrenophora graminea引起的系统性病害,是青藏高原青稞生产上危害最严重的病害。为了解青海省青稞条纹菌的遗传分化水平,运用rDNA-ITS分子标记技术对青海省青稞条纹病菌群体进行遗传多样性分析。单倍型多样性(H)和邻接聚类分析数据表明,所有变异位点共定义了5个单倍型,75个rDNA-ITS单倍型聚成5支,且遗传相似度较高(0.002~0.027),与单倍型结果一致。青海青稞条纹病群体的遗传多样性较低,且遗传多样性与地理位置的分布无相关性。研究结果为明确青海省青稞条纹病的传播规律提供理论依据。

青稞条纹病原菌遗传多样性及其致病性差异分析

条纹病是重要的种传真菌病害之一,能对青稞生产造成严重产量损失。为明确分布于青海的青稞条纹病原菌致病性差异及遗传多样性,本研究比较了分离自青海省不同地区18个条纹菌菌株形态特征差异,利用rDNA-ITS序列分析菌株间遗传多样性,同时测定了病菌致病性变异情况。青稞条纹病原菌于PDA培养基上菌落颜色多样,菌落质地的疏松度和边缘的规则程度都有一定的差异;在PDA培养基上不能产生分生孢子;菌株培养7 d后菌落直径范围为27.4~81.1 mm,菌株的生长速度存在显著差异。致病性分化结果显示,条纹病原菌株对青稞品种的致病性存在差异,可将18个测试菌株分成2个组,且致病性与病菌地区来源无明显相关性。依据系统进化树分析结果,在欧氏距离为9.58时将18个菌株分成2个亚组,说明条纹菌遗传多样性水平较低。菌株间亲缘关系与其来源地区无明显相关性,说明条纹病原菌在不同地区存在较多的交流。本研究能为青稞条纹病的防治和后续研究中菌株的选择提供理论依据。

甘肃省大麦条纹病病原菌致病力分化、rDNA-ITS及遗传多样性分析

为明确甘肃省大麦条纹病病原菌麦类核腔菌Pyrenophora garminea的致病力分化、r DNA-ITS序列特征及变异,采用"三明治"法测定甘肃省大麦条纹菌的致病力,通过r DNA-ITS序列分析菌株间变异类型,并对菌株进行ISSR遗传多样性分析。结果表明,共筛选到43株大麦条纹病菌,生长7 d后的菌落直径为2.60~7.93 cm,其中菌株TB生长速度最快,菌株JT生长速度最慢,强、中等和弱致病力菌株分别为2、21和20株;43株菌的核糖体DNA-ITS序列与麦类核腔菌菌株SMCD2015同源性在99%以上;在9个菌株中检测到15个变异位点,共17种变异类型;8个ISSR标记从43个菌株中扩增出41条带,平均每个标记5.13条带,90.24%片段具有多态性,遗传相似系数为0.44~1.00,平均值为0.71,当遗传相似系数为0.68时,可将供试菌株划分为4个类群。表明甘肃省大麦条纹病病原菌存在致病力分化,菌株核糖体DNA-ITS序列变异丰富,且菌株间遗传结构复杂。

大麦条纹病菌致病性分析及抗性种质精细鉴定

为探明大麦条纹病菌Pyrenophora graminea的致病性差异,鉴定筛选抗病大麦种质材料,将15株大麦条纹病菌菌株通过三明治法种子幼芽接种至5个鉴别品种,分析菌株的致病性分化情况;通过在田间孢子喷雾穗部接种和三明治法种子幼芽接种对145个田间种植表现抗病品种进行抗条纹病精细鉴定。结果显示,15株菌株对5个鉴别品种致病性有一定差异,可划分为9个致病类型,其中致病类型Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ为优势致病类型,每个致病类型菌株数均占总菌株数的20.0%,其它致病类型的菌株均占总菌株数的6.7%;致病类型Ⅰ菌株致病力最强,对5个鉴别品种表现高感。孢子悬浮液喷雾接种田间试验结果显示,90个大麦品种表现为抗病,占总数的62.1%,其中表现免疫的品种12个、高抗品种26个、中抗品种52个,分别占总数的8.3%、17.9%、35.9%。种子幼芽接种温室条件下发病鉴定结果显示,90个抗病品种接种致病类型ⅢP05菌株,对其表现抗病的品种有28个,占供试品种总数的31.1%,表现免疫的品种10个、高抗品种7个、中抗品种11个,分别占供试品种总数的11.1%、7.8%、12.2%;接种致病类型ⅠP01菌株,对其表现抗病的品种14个,占总数的15.6%,其中表现免疫的品种4个、中抗品种10个,分别占总数的4.4%和11.1%。说明强毒性菌株P01可作为大麦条纹病抗性鉴定接种的常用菌株。