蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939增殖及cyclin E和P27蛋白表达影响的研究

目的已有诸多研究显示中药蟾蜍灵具有明显抑制肿瘤增殖的作用,观察蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939的cyclin E和P27表达的影响,探讨其调控胆管癌细胞增殖的途径和机制。方法 MTT比色法观察不同浓度蟾蜍灵(0.1、1、10μmol/L)对人胆管癌细胞QBC939增殖的影响;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)实验检测蟾蜍灵毒性;流式细胞术检测人胆管癌细胞QBC939细胞周期的变化;Western blot法测定cyclin E、P27蛋白水平变化。结果 MTT比色法结果表明蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939生长具有较强的抑制作用,并在一定范围内具有时间和浓度依赖性,流式细胞仪检测细胞周期阻滞在G0/G1期,具有良好的量效关系。Western blot测定cyclin E蛋白表达量下降,P27蛋白表达量升高。结论蟾蜍灵可能是通过阻滞细胞周期,减少cyclinE蛋白表达,增加P27蛋白表达,来达到抗肿瘤作用。

阻断NF-κB信号通路对人肝门部胆管癌细胞QBC939增殖的影响

目的:研究阻断NF-κB信号通路对人肝门部胆管癌细胞QBC939生长增殖的影响。方法:常规培养QBC939细胞,采用PDTC(100μmol/L)阻断NF-κB信号通路,Western blot检测核内P65蛋白水平的表达,CCK-8检测细胞生长增殖抑制率,流式细胞仪观察细胞周期与凋亡的变化情况。结果:经PDTC阻断NF-κB信号通路后,与对照组相比,细胞核内P65蛋白水平明显下降(P<0.05)。CCK-8检测显示细胞增殖活性明显受到抑制,并随时间的延长而愈渐明显,12、24、36h后细胞增殖抑制率分别为(22.53±0.03)%、(46.54±0.03)%、(58.02±0.03)%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测发现实验组G0/G1期细胞比例高于对照组,分别为(68.53±1.72)%、(38.3±1.35)%,差异有统计学意义(P<0.05);细胞凋亡率在实验组为(27.68±2.77)%,对照组仅为(9.27±2.36)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:阻断NF-κB信号通路诱导人肝门部胆管癌细胞G_0/G_1期阻滞及细胞凋亡,从而抑制细胞生长与增殖,提示NF-κB信号通路组成性激活参与人肝门部胆管癌的发生发展,以NF-κB信号通路作为治疗的靶点可能给人肝门部胆管癌带来新的治疗选择。

AMD3100对胆管癌CXCR4基因、蛋白表达及QBC939细胞增殖能力的影响

目的:探讨CXCR4基因在胆管癌组织标本及人胆管癌细胞株QBC939中的表达情况,分析AMD3100应用对CXCR4基因表达及QBC939细胞的生物学行为变化。方法:收集人胆管癌组织标本,培养人胆管癌细胞株QBC939,加入不同浓度的AMD3100抑制剂。采用RT-PCR和Western blot方法,分别检测人胆管癌标本及转染AMD3100抑制剂前后QBC939胆管癌细胞株中CXCR4基因和蛋白的表达。应用CCK-8试剂盒对转染后细胞增殖活性进行检测。通过克隆形成实验观察AMD3100对细胞克隆形成的抑制。结果:CXCR4基因及其蛋白在胆管癌组织标本及人胆管癌细胞株QBC939中均高度表达。不同浓度AMD3100抑制剂对QBC939胆管癌细胞株的增殖抑制活性取决于AMD3100抑制剂的孵育浓度、孵育时间。其中,转染不同浓度抑制剂24 h,并未对细胞增殖造成影响;转染48 h后,0.1μg·ml^(-1)AMD3100无明显影响,1μg·ml^(-1)、5μg·ml^(-1)的AMD3100抑制剂明显抑制了细胞的增殖;转染72 h后,各浓度均对细胞增殖有明显抑制作用。克隆形成实验分析显示,抑制CXCR4基因表达明显延长了克隆体形成时间,使克隆体体积和数目减少。结论:AMD3100抑制剂影响人胆管癌细胞株QBC939的增殖能力,抑制CXCR4基因和蛋白的表达。

PPAR-γ在肝门部胆管癌中的表达及其配体激活后对胆管癌细胞的作用

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)在人类肝门部胆管癌细胞系QBC939中的表达及经其配体吡格列酮(pioglitazone)激活后对QBC939细胞生长的影响。方法培养QBC939细胞并分别加入不同浓度的吡格列酮进行干预培养,通过RT-PCR检测QBC939中PPAR-γmRNA的表达;光镜下细胞计数了解吡格列酮干预后对细胞增殖的作用;流式细胞技术了解吡格列酮对QBC939细胞周期及凋亡的影响。结果QBC939中有PPAR-γmRNA表达;PPAR-γ经其配体激活后明显抑制细胞增殖,使细胞周期出现G2/M期停滞,并诱导细胞凋亡。结论PPAR-γ经其配体激活后通过抑制细胞增殖及促使细胞周期G2/M期停滞而抑制细胞的生长,且诱导细胞凋亡的发生,因此PPAR-γ有可能成为胆管癌治疗的新的分子靶点。

反义CD147分子对人胆管癌细胞株侵袭性影响的实验研究

目的探讨反义CD147分子对人胆管癌细胞株QBC939侵袭性的影响。方法构建含反义CD147分子片段的重组真核表达质粒,将人胆管癌细胞株QBC939分为三组:(1)反义CD147组,运用重组真核表达质粒as CD147-pc DNA3.1(-)转染QBC939细胞;(2)空质粒组,运用pc DNA3.1(-)空质粒转染QBC939细胞;(3)对照组,运用DMEM常规处理细胞。采用MTT法检测各组QBC939细胞的生长情况,RT-PCR和Western blotting法分别对三组QBC939细胞中的CD147、MMP-2、MMP-9、TIMP-2的m RNA表达水平及其对应蛋白的表达水平进行检测。结果成功构建了携带反义CD147分子片段的重组真核表达质粒。MTT法检测显示:三组QBC939细胞的生长曲线及对数生长期情况无统计学差异(P>0.05)。RT-PCR法检测显示:反义CD147组QBC939细胞中CD147和MMP-2分子的m RNA表达均低于空质粒组和对照组(P<0.05),且空质粒组与对照组相比无统计学差异(P>0.05);反义CD147组QBC939细胞中MMP-9和TIMP-2分子的m RNA表达与空质粒组和对照组相比无统计学差异(P>0.05)。Western blotting检测发现:与空质粒组和对照组相比,反义CD147组QBC939细胞中CD147和MMP-2分子的蛋白表达明显降低(P<0.05),空质粒组与对照组相比无统计学差异(P>0.05);与空质粒组和对照组相比,反义CD147组QBC939细胞株中MMP-9和TIMP-2分子的蛋白表达无统计学差异(P>0.05)。结论 (1)反义CD147对胆管癌细胞株QBC939的生长无影响;(2)反义CD147对胆管癌细胞株QBC939中MMP-9和TIMP-2的m RNA表达及对应蛋白表达无影响;(3)反义CD147降低胆管癌细胞株QBC939中CD147和MMP-2的m RNA表达及对应蛋白表达,可能会降低胆管癌细胞株的侵袭性。

NF-κB特异性抑制剂PDTC对人肝门部胆管癌细胞增殖及SMYD3表达的影响

【目的】研究核转录因子-κB(NF-κB)特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲盐酸对肝门部胆管癌QBC939细胞增殖及组蛋白甲基转移酶表达的影响。【方法】不同浓度的PDTC作用于QBC939细胞不同时间后,CCK-8测定其对QBC939细胞增殖的抑制率,流式细胞仪观察QBC939细胞的周期变化情况,RT-PCR检测PDTC作用下QBC939细胞中SMYD3 mRNA的表达情况,Western blot法检测QBC939细胞内SMYD3蛋白的表达。【结果】经PDTC处理的实验组,肿瘤细胞增殖活性明显受到抑制(P<0.05),呈时间和剂量依赖性;与对照组相比,PDTC作用后QBC939细胞G0/G1期细胞比例上升(P<0.05),并同时伴有癌细胞内SMYD3 mRNA和蛋白表达的降低(P<0.01),且呈明显的剂量依赖关系。【结论】PDTC具有显著抑制肝门部胆管癌QBC939细胞生长的作用,其机制可能与细胞增殖抑制、周期阻滞、以及NF-κB、SMYD3表达抑制有关。

基于新型光敏剂的光动力治疗在胆管癌中的应用

目的验证新型叶绿素类光敏剂——2-1-己氧乙基-2-去乙烯基卟吩e6三钠盐(HCE6),光动力疗法对于QBC939系胆管癌细胞的光动力治疗作用,并探讨其量效关系。方法 CCK-8检测652 nm不同激光光强度下不同浓度(0、0.3、0.5、1.0、15、2.0 mg·L-1)光敏剂HCE6光动力处理下细胞的增殖率,得出最适光动力剂量。建立QBC939系胆管癌细胞荷瘤裸鼠模型,光敏剂尾静脉注射0.5 mg·kg-1,24 h后接受激光治疗(激光剂量:120 J·cm-2,功率0.2 W,治疗20 min),激光治疗后1、3、5、7、10 d观察实验组和对照组瘤体体积变化差异,并对比观察瘤体病理变化。结果在最适光照强度2.7 J·cm-2(功率0.9 W,PDT处理5 min)剂量,随着光敏剂浓度升高,细胞增殖率逐渐下降,最适完全抑制浓度为1.5 mg·L-1;超过这个浓度,细胞增值率变化无差异。荷瘤裸鼠模型实验中实验组和对照组有明显肿瘤体积差异(P<0.05),光动力治疗第10天,实验组与对照组体积差异明显(P<0.05),实验组瘤块体积(0.5±0.010)cm3,而对照组(2.25±0.015)cm3。接受PDT组与对照组比较肿瘤生长速度明显受限。结论体内外实验表明光敏剂HCE6对QBC939系人胆管癌细胞生长具有明显的抑制作用。

体外分层渗透共培养研究胆管癌细胞株QBC939对正常内皮细胞的作用

目的在体外分层渗透共培养体系中研究胆管癌细胞对正常内皮细胞的作用。方法建立胆管癌细胞株QBC939与正常内皮细胞的体外分层渗透共培养体系，以同期单独培养的正常内皮细胞为对照，用免疫荧光法检测内皮细胞与胆管癌细胞共培养后，内皮细胞Factin，pp125FAK，蛋白水解酶MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达变化，用Realtime PCR，Western印迹检测内皮细胞共培养前后，pp125FAK，MMP-2、MMP-9、uPA的mRNA及蛋白表达变化。结果与同期单独培养的正常内皮细胞对照相比，内皮细胞Factin表达增强，pp125FAK、MMP-2、MMP-9、uPA的mRNA及蛋白表达增加（P〈0．01）。结论胆管癌细胞能通过旁分泌作用导致内皮细胞骨架系统改变，并能诱导内皮细胞蛋白水解酶的基因表达及蛋白合成，表明肿瘤细胞对邻近内皮细胞还可以通过肿瘤细胞的内分泌、旁分泌等作用分泌各种细胞因子，作用于内皮细胞上的特异性受体，发挥其对内皮细胞mRNA表达的调控作用，而导致内皮细胞发生形态、行为的改变。