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建立检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2的mRNA相对表达水平的RT-qPCR方法
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作者 林小瑞 张铭润 +5 位作者 王陈芸 周玮 叶尤松 龙维虎 李哲丽 唐东红 《实验动物科学》 2024年第2期35-40,共6页
目的本研究旨在建立一种实时荧光定量PCR方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平。方法使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)... 目的本研究旨在建立一种实时荧光定量PCR方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平。方法使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)的ABCG2核苷酸序列号NM_001032919.1及内参GAPDH核苷酸序列号NM_001195426.1,借助Primer premier 5.0软件设计PCR引物。提取猕猴新鲜肾组织的总RNA,并反转录合成cDNA。接着,利用PCR引物进行实时荧光定量PCR扩增,并根据反应体系中荧光的变化情况定量分析ABCG2的mRNA相对表达水平。结果PCR产物测序结果显示,扩增的ABCG2和GAPDH核苷酸序列与NCBI上猕猴的序列同源性分别为90.91%和91.14%。ABCG2和GAPDH的扩增效率均达到80%~120%,实时荧光定量PCR标准曲线的熔解曲线为单峰,R2接近1。结论本研究建立的检测猕猴ABCG2 mRNA实时荧光定量检测方法,为研究高尿酸血症的发病机制以及新药开发奠定基础。 展开更多
关键词 猕猴 实时荧光定量pcr 三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2
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山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 李鹏飞 高桂琴 +6 位作者 周广青 吴锦艳 颜新敏 曹小安 何继军 袁莉刚 尚佑军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2259-2266,共8页
山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在... 山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。 展开更多
关键词 山羊地方性鼻内肿瘤病毒 羊内源性逆转录病毒 TAQMAN 荧光定量rt-pcr
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鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 张靖鹏 陈翠腾 +5 位作者 林琳 付环茹 李兆龙 江斌 黄瑜 万春和 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期860-866,共7页
旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进... 旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。 展开更多
关键词 信鸽 鸽微RNA病毒 3 C基因 序列分析 实时荧光定量rt-pcr方法
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鹅源class I类NDV生物学特性的研究及荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 李长宇 孙军峰 +3 位作者 赵冉 王芳芳 韩宗玺 刘胜旺 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期923-930,共8页
为了解鹅源class I类新城疫病毒(NDV)的生物学特性,本研究以2022年在安徽活禽市场的鹅中分离到的AH713/22株为研究对象,测定其全基因组序列,分析其基因组分子特征和遗传进化特性;将AH713/22株感染鸡胚,接种1日龄雏鸡脑内,分析其致病性;... 为了解鹅源class I类新城疫病毒(NDV)的生物学特性,本研究以2022年在安徽活禽市场的鹅中分离到的AH713/22株为研究对象,测定其全基因组序列,分析其基因组分子特征和遗传进化特性;将AH713/22株感染鸡胚,接种1日龄雏鸡脑内,分析其致病性;利用制备的单因子血清进行交叉血凝抑制试验,分析其抗原性;将AH713/22株56℃水浴不同时间后检测HA效价,分析其耐热特性。结果显示,AH713/22株基因组长15198 bp,具有典型的class I类NDV的基因组结构和分子特征,属于基因1.1.2亚型。F蛋白裂解位点为ERQERL,HN蛋白长度不同于已往报道的病毒株,含有618个氨基酸;鸡胚平均死亡时间(MDT)为134 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为0.32,表明AH713/22属于弱毒株;抗原性检测结果显示AH713/22株与class II类基因II型NDV以及class I类代表性NDV之间存在不同程度的抗原性差异;耐热性试验显示AH713/22株在56℃热处理60 min后HA效价仍无显著变化,表明AH713/22株具有优良的热稳定性。进一步基于class I类基因1.1.2亚型NDV F基因的序列比对分析,针对其保守区域设计引物和探针,建立了荧光定量RT-PCR检测方法,结果显示该方法对质粒标准品的检测限为10^(2)拷贝数/μL,且能够特异性的检测class I类1.1.2亚型NDV,与其他常见的禽呼吸道病原核酸均无交叉反应。该方法用于临床样品检测结果与常规PCR检测结果一致。本研究系统鉴定了一株鹅源class I类NDV的遗传和分子生物学特性,加深了对我国class I类NDV遗传演化的认知,并建立了适用于我国优势基因型(1.1.2亚型)NDV的检测方法,为class I类NDV的监测和流行病学调查提供了技术支撑。 展开更多
关键词 新城疫病毒 分子特征 抗原性 热稳定性 荧光定量rt-pcr方法
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赤羽病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 李超 王素春 +5 位作者 隋金钰 潘俊慧 魏世萌 祁倩 周凯钰太 王楷宬 《中国动物检疫》 CAS 2024年第9期111-117,共7页
为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并... 为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并利用该方法与AKAV检疫行业标准推荐方法同时对临床采集的80份牛羊血液样品进行检测,以检验方法的临床应用效果。结果显示:本研究建立的检测方法敏感性较高,最低检测限为13.4 copies/μL;特异性良好,与口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、牛白血病病毒等均无交叉反应;组内试验变异系数为0.93%~2.47%,组间试验为1.25%~2.76%,重复性良好;利用建立的方法从80份临床样品中检出AKAV阳性样品21份,该检测结果与AKAV检疫行业标准推荐方法的符合率为98.75%。结果表明,本研究建立的AKAV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性高,特异性及重复性好,适用于赤羽病临床检测,为赤羽病病原学监测和诊断技术标准开发提供了技术支撑。 展开更多
关键词 赤羽病病毒 实时荧光定量rt-pcr 方法建立 初步应用
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3种苹果病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立
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作者 李紫腾 潘媛 +4 位作者 马子文 胡同乐 王树桐 曹克强 王亚南 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期84-92,共9页
苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病... 苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病毒,本研究根据ASPV、ASGV和ApNMV基因组保守序列设计特异引物建立了3种病毒高灵敏度的实时荧光定量PCR检测体系(Real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)。结果表明:引物ASGV-qF/qR-1、ASPV-qF/R-2和ApNMV-qF/R-3有较高的特异性,最适宜的退火温度分别为60℃、58℃和58℃,ASGV、ASPV和ApNMV 3种病毒的RT-qPCR体系比常规RT-2 PCR检测体系灵敏度高100倍,最低检出限分别为82.6、1.49×10^(2)和13.3 copies/μL。检测体系的Ct值的变异系数均小于5%,组间的变异系数在5%以内。河北农业大学果园中经RT-PCR确定带毒的88棵苹果树RT-qPCR检出率为100%,表明建立的RT-qPCR方法的可靠性和稳定性高,适用于田间果树3种病毒的检测,为苹果病毒的准确诊断提供了技术支撑。 展开更多
关键词 苹果茎沟病毒 苹果茎痘病毒 苹果坏死花叶病毒 荧光定量rt-pcr检测体系
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葡萄浆果内坏死病毒RT-q PCR检测技术建立及其在葡萄砧木中的时空分布规律
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作者 张英 原青云 +3 位作者 任芳 胡国君 范旭东 董雅凤 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第14期2771-2780,共10页
【背景】葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus,GINV)是近年来在中国报道的一种正单链RNA病毒,该病毒发生普遍且危害严重。高灵敏的检测技术是病毒田间监测和无病毒苗木培育的关键。【目的】建立灵敏度较高的GINV... 【背景】葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus,GINV)是近年来在中国报道的一种正单链RNA病毒,该病毒发生普遍且危害严重。高灵敏的检测技术是病毒田间监测和无病毒苗木培育的关键。【目的】建立灵敏度较高的GINV逆转录实时荧光定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测体系;明确不同葡萄砧木对GINV的敏感性;明确GINV在寄主植株中的时空分布规律,为该病毒的监测预警提供技术支撑。【方法】根据GenBank已登录GINV的复制酶(replicase,RP)、移动蛋白(movement protein,MP)和外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列设计6套引物,通过常规RT-PCR和RT-qPCR筛选特异性强、扩增效果好的引物。再通过对退火温度和引物浓度等反应条件的优化建立GINV的SYBR Green I染料法RT-qPCR检测体系,并进一步对该技术的灵敏度、特异性和田间适用性进行评价。将GINV接种到贝达、SO4、101-14、140R和1103P 5种葡萄砧木上进行症状观察和病毒检测,以筛选GINV敏感性较高的指示植物。基于所建立的RT-qPCR技术对接种GINV葡萄砧木的不同生长时期、不同部位样品进行GINV检测,从而明确GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。【结果】建立了GINV SYBR Green I染料法RT-qPCR检测技术体系,其最佳引物为GINVRPYGF2/R2,最佳引物浓度为300 nmol·L^(-1),最佳退火温度为58.4℃。该技术对GINV的检测特异性强,其检测灵敏度达常规RT-PCR的1 000倍。症状观察结果表明贝达感染GINV的症状最为严重,表现为叶片系统性坏死,而其他砧木叶片仅表现褪绿斑驳和环斑症状。RT-qPCR检测结果表明GINV在EL27时期(坐果期)的相对含量最高,5个品种间的病毒相对含量在EL12(花序分明期)和EL27时期间无显著差异,EL31时期(果实增大期)的贝达与SO4、101-14、140R和1103P的病毒相对含量存在显著差异;GINV的相对含量在不同组织部位存在较大差异,由高到低依次为下部叶片、上部叶片、上部茎秆、下部茎秆、根部。【结论】建立了灵敏度高、特异性强的GINV RT-qPCR检测方法,利用该方法明确了GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。 展开更多
关键词 葡萄浆果内坏死病毒 逆转录实时荧光定量pcr 葡萄砧木 时空分布
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韦塞尔斯布朗病病毒RT-PCR快速检测方法的建立及应用
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作者 王奕婷 张风荣 +5 位作者 冯之航 郁蕾 薛俊欣 陈翔 王艳 赵光伟 《中国动物检疫》 CAS 2024年第10期96-101,共6页
为实现对韦塞尔斯布朗病病毒(Wesselsbron virus,WSLV)的快速检测,根据WSLV NS5基因保守序列,设计特异性扩增引物和探针,建立WSLV的TaqMan荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测方法,并验证方法的敏感性、特异性及临床可行性。结果显示:所建立的... 为实现对韦塞尔斯布朗病病毒(Wesselsbron virus,WSLV)的快速检测,根据WSLV NS5基因保守序列,设计特异性扩增引物和探针,建立WSLV的TaqMan荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测方法,并验证方法的敏感性、特异性及临床可行性。结果显示:所建立的两种方法的核酸检测下限分别为10、100 copies/μL,对日本脑炎病毒、西尼罗病毒和坦布苏病毒核酸均无交叉反应;分别利用建立的两种检测方法对100份入境马匹样品进行检测,未检出WSLV阳性,与南非参考实验室提供的双重荧光RT-PCR检测方法结果一致。结果说明,所建的两种方法敏感性高、特异性强,可用于临床样本检测,为韦塞尔斯布朗病的出入境检验检疫、流行病学调查及防控提供了技术支撑。 展开更多
关键词 韦塞尔斯布朗病病毒 荧光定量rt-pcr rt-pcr 快速检测
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三疣梭子蟹附肢再生过程中qRT-PCR内参基因的筛选与Wnt7b表达研究应用
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作者 王思翔 付媛媛 +3 位作者 翟伟 郑霞 刘磊 王春琳 《核农学报》 CAS 北大核心 2025年第1期29-37,共9页
为筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)附肢再生过程中的最适内参基因,以附肢再生不同阶段的三疣梭子蟹为研究对象,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对细胞骨架蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、18S rRNA(18S)... 为筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)附肢再生过程中的最适内参基因,以附肢再生不同阶段的三疣梭子蟹为研究对象,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对细胞骨架蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、18S rRNA(18S)、转录延伸因子基因(EF1α)、核糖体蛋白L18基因(RPL18)、细胞色素C氧化酶基因(COX)和组蛋白基因(HIS)共7个候选内参基因在肌肉、眼柄、血淋巴、肝胰腺、鳃、心脏和再生附肢共7种组织中的表达水平进行检测,并利用△Ct、geNorm、NormFinder和BestKeeper程序对候选内参基因的稳定性进行评价,筛选出合适的内参,最后以最适内参基因作为参考,分析再生相关基因Wnt7b的表达水平。结果显示,在不同组织中综合稳定性最好的是RPL18,而在不同再生阶段的再生附肢中β-actin和RPL18基因做双内参基因更适合。以RPL18和β-actin作双内参基因研究Wnt7b的表达水平时发现,Wnt7b基因在三疣梭子蟹附肢再生过程中的表达呈先上升后下降再上升的趋势;Wnt7b基因在三疣梭子蟹各组织中均有表达,除再生附肢和血淋巴外其他组织中的表达量都较低。本研究结果为甲壳类再生发育相关研究内参基因的选择及分子调控机制研究提供了参考。 展开更多
关键词 三疣梭子蟹 内参基因 附肢再生 实时荧光定量pcr
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Evaluation of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR Analysis in Manila Clam Ruditapes philippinarum Under Hypoxic Stress 被引量:1
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作者 JING Hao ZHOU Liqing +4 位作者 GONG Miao TU Kang LIU Zhihong WU Biao SUN Xiujun 《Journal of Ocean University of China》 SCIE CAS CSCD 2023年第4期1059-1067,共9页
Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)has been widely used for gene expression analysis,and selection of reference genes is a key point to obtain accurate results.To find out optimal reference genes for qRT-PCR in Manila... Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)has been widely used for gene expression analysis,and selection of reference genes is a key point to obtain accurate results.To find out optimal reference genes for qRT-PCR in Manila clam Ruditapes philippinarum in response to hypoxia,different tissues were used and compared to evaluate the stability of candidate reference genes under low oxygen stress(DO 0.5mgL^(−1) and DO 2.0mgL^(−1))and normal condition(DO 7.5mgL^(−1)).Seven candidate reference genes were selected to evaluate the stability of their expression levels.The reference genes were evaluated by Delta Ct,BestKeeper,NormFinder and geNorm,and then screened by RefFinder calculation.Under hypoxic stress of 0.5mgL^(−1),the most suitable reference gene for gill and hepatopancreas was RPL31,and the optimal reference genes for axe foot and adductor muscle were TUB and HIS,respectively.For hypoxic stress of 2.0mgL^(−1),the most stable reference gene for gill and hepatopancreas was RPL31,and the optimal reference genes for axe foot and adductor muscle were RPS23 and EF1A,respectively.At the normal condition,HIS and EF1A were identified as the optimal internal reference genes in gill and hepatopancreas respectively,and GFRP2 was the best internal reference gene for axe foot and adductor muscle.The present findings will provide important basis for the selection of reference genes for qRT-PCR analysis of gene expression level in bivalves under hypoxic stress,which might be helpful for the analysis of other molluscs too. 展开更多
关键词 CLAM reference gene HYPOXIA quantitative real-time pcr
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球茎甘蓝qRT-PCR内参基因的筛选及稳定性验证
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作者 郭怡婷 孙世英 +4 位作者 赵文菊 王鑫淼 李晓娟 马一栋 任延靖 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期144-152,共9页
【目的】通过对已知内参基因进行筛选,确定球茎甘蓝最合适的内参基因,确保实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的准确表达。【方法】本试验选择了11种参考基因,利用GeNorm、Normalfinder和Bestkeep软件对紫色球茎甘蓝和绿色球茎甘蓝不同部位的内... 【目的】通过对已知内参基因进行筛选,确定球茎甘蓝最合适的内参基因,确保实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的准确表达。【方法】本试验选择了11种参考基因,利用GeNorm、Normalfinder和Bestkeep软件对紫色球茎甘蓝和绿色球茎甘蓝不同部位的内部参考基因进行了分析。【结果】3个分析结果显示,内参基因Tip41在球茎甘蓝不同组织部位表达最稳定。【结论】Tip41是作为内参基因的最佳选择,为球茎甘蓝后续的分子生物学相关研究提供基础。 展开更多
关键词 球茎甘蓝 内参基因 荧光定量
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猪流感病毒通用型微滴式数字RT-PCR绝对定量检测方法的建立
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作者 兰德松 顾贵波 +2 位作者 孙世宇 杨洺扬 魏澍 《中国动物检疫》 CAS 2024年第4期84-90,共7页
为建立灵敏且可绝对定量检测猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的微滴式数字RT-PCR(ddRT-PCR)方法,以SIV M基因的保守序列为靶基因,设计并合成一套特异性引物和TaqMan探针,建立了可对主要流行的H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV绝对定量检... 为建立灵敏且可绝对定量检测猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的微滴式数字RT-PCR(ddRT-PCR)方法,以SIV M基因的保守序列为靶基因,设计并合成一套特异性引物和TaqMan探针,建立了可对主要流行的H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV绝对定量检测的通用型ddRT-PCR方法。随后,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行评价,并利用临床猪鼻咽拭子样品进行检测验证。结果显示:建立的ddRT-PCR方法检测限达到1.6 copies/µL,灵敏度极高;能特异性检出H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV,与猪瘟病毒等其他常见猪病病原均无交叉反应;重复检测结果的批内和批间变异系数(CV)分别为0.75%、3.17%,重复性良好;经临床样品检测验证,建立的ddRT-PCR和荧光RT-qPCR方法分别检出阳性样品72、66份,提示前者在检测低病毒拷贝样品时较荧光RT-qPCR更优。结果表明,本研究建立的SIV通用型ddRT-PCR方法灵敏度高,特异性和重复性均良好,且在检测低病毒含量临床样本时更具优势,可作为一种对SIV感染进行早期诊断和绝对定量检测的有效方法。 展开更多
关键词 猪流感病毒 微滴式数字rt-pcr 通用型 绝对定量检测
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青鲫qRT-PCR内参基因的筛选及评价
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作者 曾丹 李菁菁 +4 位作者 周馨雨 谢成辉 唐伟伟 李林 杨品红 《湖南文理学院学报(自然科学版)》 CAS 2024年第3期50-57,共8页
为筛选出青鲫不同组织中的最适内参基因,本研究利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测β肌动蛋白(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S r RNA)和核糖体蛋白L13(... 为筛选出青鲫不同组织中的最适内参基因,本研究利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测β肌动蛋白(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S r RNA)和核糖体蛋白L13(RPL13)4个候选内参基因在青鲫脑、鳃、性腺、肾脏、肝脏、肌肉和脾脏7个组织中的表达情况,并利用ge Norm、NormFinder和BestKeeper等程序分析候选基因的表达稳定性。结果显示,4个内参基因在各组织的Ct值高低顺序依次为:β-actin>GAPDH>18S r RNA>RPL13;4个内参基因在不同组织的稳定性有所不同,综合评价分析显示其稳定性排序为RPL13>18S r RNA>β-actin>GAPDH,RPL13适合作为青鲫不同组织qRT-PCR分析的内参基因。本研究结果可为后续青鲫功能基因表达特征的研究提供技术支撑。 展开更多
关键词 青鲫 内参基因 Qrt-pcr 表达稳定性
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O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 张展 陈信全 +2 位作者 冯国金 黄慧贤 利光辉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期601-607,共7页
为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定... 为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测临床常见猪病毒,结果显示可同时检测出FMDV-O和SVV核酸,且与猪水泡性口炎病毒(VSV)、猪水疱病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)、A-1型口蹄疫病毒(FMDVA-1)核酸均无交叉反应,并可检测到FMDV-O PanAsia株、cathay株、Ind-2001株和Mya-98株等主要流行株,特异性强;该方法对含FMDV-O和SVV拼接质粒标准品的最低检测限为7.17×10^(2)拷贝/μL,敏感性高;利用该方法检测了同一时间和不同时间提取的3种不同浓度的质粒标准品,结果显示批内和批间重复性试验Ct值的变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验所建立的方法对30份临床样品进行检测,结果与各病毒单一荧光定量RT-PCR检测结果一致。本研究建立的FMDV-O和SVV双重荧光定量RT-PCR方法能够快速准确的鉴别检测FMDV-O和SVV,为口岸检疫的快速通关提供了技术手段。 展开更多
关键词 O型口蹄疫病毒 塞内卡病毒 双重rt-qpcr方法 P3基因 VP2基因
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实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用
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作者 张博奇 《智慧健康》 2024年第24期16-18,共3页
目的探讨实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用效果。方法选取2021年12月—2022年12月盘锦市疾病预防控制中心接收的麻疹与风疹患者76例为研究对象,入院后所有研究对象均接受酶联免疫吸附试验法和实时荧光定量RT-PCR法检测,... 目的探讨实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用效果。方法选取2021年12月—2022年12月盘锦市疾病预防控制中心接收的麻疹与风疹患者76例为研究对象,入院后所有研究对象均接受酶联免疫吸附试验法和实时荧光定量RT-PCR法检测,以检测患者恢复期血免疫球蛋白G(IgG)抗体水平(相对急性期是否4倍升高)为麻疹诊断金标准,对比两种检测方法的检测准确率、不同检测时间的阳性检出率。结果实时荧光定量RT-PCR法总诊断准确率为97.37%;酶联免疫吸附试验法中总诊断准确率为88.16%,比较两种方法的诊断准确率差异有统计学意义(P<0.05)。第1d,实时荧光定量RT-PCR法阳性检出率高于酶联免疫吸附试验法,差异有统计学意义(P<0.05)。第5d,实时荧光定量RT-PCR法阳性检出率低于酶联免疫吸附试验法,差异有统计学意义(P<0.05)。第2d、第3d、第4d实时荧光定量RT-PCR法和酶联免疫吸附试验法阳性检出率对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论实时荧光定量RT-PCR对麻疹、风疹检测有一定诊断作用,可以有效提高检测准确率,同时操作简单,灵敏性较高,值得在麻疹与风疹病毒检测中推广。 展开更多
关键词 麻疹 实时荧光定量rt-pcr 风疹 检测价值 检测准确率
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Synchronous Detection of DNA/RNA of Four Shrimp Viruses by Real-time Fluorescence Quantitative RT-PCR 被引量:1
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作者 Biao SHEN Zhongfa WANG +1 位作者 Xingjuan HU Songye GU 《Agricultural Biotechnology》 CAS 2014年第5期48-50,共3页
[ Objective] This study aimed to establish a simultaneous detection method of shrimp viruses by real-time fluorescence quantitative RT-PCR, to improve the efficiency of inspection and quarantine. [ Method] A novel rea... [ Objective] This study aimed to establish a simultaneous detection method of shrimp viruses by real-time fluorescence quantitative RT-PCR, to improve the efficiency of inspection and quarantine. [ Method] A novel real-time fluorescence quantitative RT-PCR assay was established and optimized for simultaneously detecting DNA/RNA of four shrimp viruses (WSSV, IHHNV, TSV and YHV ). [ Result] The optimized real-time fluorescence quantitative RT-PCR system gener- ated typical amplification curves with high amplification efficiencies (E = 1.06, 1.07, 0.92 and 0.92, respectively), good hnear relationship ( r = 1 ), uniform repeatability ( standard deviation = 0.05 - 0.46 ; variation coefficient = 0.26% - 1.62% ) and high sensitivity, exhibiting no significant differences compared with re- al-time fluorescence quantitative PCR (average error of Ct value = 0.04 -0.40; T = 0.53 -2.50; P 〉 0.05 ). The total detection time was about 1 h. [ Conclusion] The optimized real-time fluorescence quantitative RT-PCR system can be used for rapid detection of WSSV, IHHNV, TSV and YHV. 展开更多
关键词 Real-time fluorescence quantitative rt-pcr Shrimp viruses Synchronous amplification of DNA/RNA
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Detection and clinical significance of multidrug resistance-1 mRNA in bone marrow cells in children with acute lymphoblastic leukemia by real-time fluorescence quantitative RT-PCR 被引量:1
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作者 Yuan Lu Runming Jin +3 位作者 Kun Yang Lirong Sun Yan Xia Xiuying Pang 《Journal of Nanjing Medical University》 2008年第3期153-158,共6页
Objective: Multidrug resistance(MDR) is one of the most important reasons for treatment failure and recurrence of acute leukemia. Its manifestations are different in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL... Objective: Multidrug resistance(MDR) is one of the most important reasons for treatment failure and recurrence of acute leukemia. Its manifestations are different in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL) which may be due to different detection methods. This study was to detect the expression of MDR1 mRNA in bone marrow cells of children with ALL by real-time fluorescence- quantitative reverse transcription polymerase-chain reaction(FQ-RT-PCR), and combine minimal residual desease(MRD) detection by flow cytometry(FCM) and to study their relationship with treatment response and prognosis of ALL. Methods:The MDR1 mRNA levels in bone marrow cells from 67 children with ALL[28 had newly diagnosed disease, 27 had achieved complete remission(CR), 12 recurrent] and 22 children without leukemia were detected by FQ-RT-PCR. MRD was detected by FCM. The patients were observed for 9-101 months, with a median of 64 months. Results:Standard curves of human MDR1 and GAPDH genes were constructed successfully. MDR1 mRNA was detected in all children with a positive rate of 100%. The mRNA level of MDR1 was similar among the newly diagnosed ALL group, CR group, and control group(P 〉 0.05), but significantly higher in the recurrence group than that in newly diagnosed disease group and control group(0.50 ± 0.55 vs. 0.09 ± 0.26 and 0.12 ± 0.23, P〈 0.05). 54 ALL patients were followed up, and it was found that MDR1 mRNA level was significantly higher in ALL patients within 3 years duration than that of ALL patients with 3-6 years and over 6 years duration(0.63 ± 0.56 vs. 0.11 ± 0.12 and 0.04 ± 0.06, P〈 0.01). For the 28 children with newly diagnosed disease, the MDR1 mRNA level was similar between WBC 〉 50 ~ 109 group and WBC〈50 × 10^9 group(P〉 0.05). In the 33 CR patients, the MDR1 mRNA level was significantly higher in MRD〉10a group than that in MRD〈10a group(0.39 ± 0.47 vs. 0.03 ± 0.03, P 〈 0.05). Conclusion:The sensitivity and specificity of FQ-RT-PCR in detecting MDR1 mRNA in bone marrowy cells of children with ALL patients are high. MDR1 mRNA is expressed in children with and without leukemia. MDR1 mRNA is highly expressed in the CR ALL patients with high MRD, recurrence and short duration(within 3 years). Monitoring MRD and the MDR1 mRNA level might be helpful for individual treatment. 展开更多
关键词 LEUKEMIA CHILDREN multidrug resistance MDR1 gene minimal residual disease real-time fluorescence quantitative rt-pcr
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Quantitative analysis of RNA levels from single hepatocytes in vivo: combined use of real-time RT-PCR and laser microdissection
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作者 SHI Xin Jǒg Kleeff +5 位作者 ZHU Zhao - wen Bruno Schmied TANG Wen - hao Arthur Zimmermann Markus W. Bǔchle Helmut Friess 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期2285-2288,共4页
AIM: The manner in which a cell responds to and influences its environment is ultimately determined by the genes that are expressed. To better understand cellular functions, the isolation of single cells and subsequen... AIM: The manner in which a cell responds to and influences its environment is ultimately determined by the genes that are expressed. To better understand cellular functions, the isolation of single cells and subsequent quantification of the expressed genes is essential. METHODS: Normal liver tissue was obtained from operation, snap-frozen in liquid nitrogen and sectioned in crystat. Individual hepatocytes were microdissected. RNA was extracted, then reverse transcribed and amplified using real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR). RESULTS: Single hepatocytes were dissected by laser beam and catapulted to the microcentrifuge cap which was put above the slide. In this way, cells were collected, RNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and used for analysis of RNA expression by real-time quantitative PCR. The amplification results showed that quantitation of the RNA inside the cell was compatible with the number of cells. CONCLUSION: The expression of RNA in single cells can be quantitated successfully by using laser microdissection and real-time PCR. These techniques provide an opportunity to monitor in vivo gene expression levels in single hepatocytes. 展开更多
关键词 RNA 肝细胞 实时rt-pcr 激光显微切割 数量性状
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THE DETECTION OF MDR1 GENE EXPRESSION USING FLUOROGENIC PROBE QUANTITATIVE RT-PCR METHOD
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作者 高劲松 马刚 +3 位作者 仝明 陈佩毅 王传华 何蕴韶 《Chinese Journal of Cancer Research》 SCIE CAS CSCD 2001年第2期96-100,共5页
Objective: To establish a fluoregenic probe quantitative RT-PCR (FQ-RT-PCR) method for detection of the expression of MDR1 gene in tumor cells and to investigate the expression of MDR1 gene in patients with lung cance... Objective: To establish a fluoregenic probe quantitative RT-PCR (FQ-RT-PCR) method for detection of the expression of MDR1 gene in tumor cells and to investigate the expression of MDR1 gene in patients with lung cancer. Methods: The fluorogenic quantitative RT-PCR method for detection of the expression of MDR1 gene was established. K562/ADM and K562 cell lines or 45 tumor tissues from patients with lung cancer were examined on PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detection machine. Results: the average levels of MDR1 gene expression in K562/ADM cells and K562 cells were (6.86±0.65)× 107 copies/μg RNA and (8.49±0.67)×105 copies/μg RNA, respectively. The former was 80.8 times greater than the latter. Each sample was measured 10 times and the coefficient variation (CV) was 9.5% and 7.9%, respectively. Various levels of MDR1 gene expression were detected in 12 of 45 patients with lung cancer. Conclusion: Quantitative detection of MDR1 gene expression in tumor cells was achieved by using FQ-RT-PCR. FQ-RT-PCR is an accurate, and sensitive method and easy to perform. Using this method, low levels of MDR1 gene expression could be detected in 24% of the patients with lung cancer. 展开更多
关键词 Fluorogenic quantitative rt-pcr/MDR1 Expression/Real time DETECTION
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Real-time Quantitative PCR Analysis of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2(VEGFR-2) Expression at Zebrafish Different Developmental Stages 被引量:2
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作者 孙桂金 潘杰 +2 位作者 刘可春 王雪 王思锋 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2010年第4期118-120,共3页
[Objective]To investigate the expression of zebrafish vascular endothelial growth factor-2(VEGFR-2) at different developmental stages.[Method]Total RNAs were extracted from 12,24,48,72 and 96 hpf stage zebrafish emb... [Objective]To investigate the expression of zebrafish vascular endothelial growth factor-2(VEGFR-2) at different developmental stages.[Method]Total RNAs were extracted from 12,24,48,72 and 96 hpf stage zebrafish embryos and larvae.Real-time quantitative RT-PCR was performed to examine the expression of VEGFR-2.The data were analyzed by 2^-△△Ct method.[Result]The expression level of VEGFR-2 gene increased gradually from 12 to 72 hpf,and subsequently decreased at 96 hpf.The expression level was lowest at 12 hpf,highest at 72 hpf,and had significant differences when compared with that of other developmental stages.[Conclusion]The expression level of VEGFR-2 increases gradually before blood vessel maturation and decreases as blood vessels mature. 展开更多
关键词 ZEBRAFISH Real-time quantitative pcr VEGFR-2
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