基于RAPD的SCAR分子标记技术鉴定虎纹蛙及引进种

为了对引进种泰国虎纹蛙加强种质监测,本文对泰国虎纹蛙和中国虎纹蛙进行了SCAR标记研究。在对2种蛙随机扩增多态DNA(RAPD)标记研究的基础上,选用随机引物OPP5和OPZ19对2种蛙进行扩增,将2个特异性扩增片段OPP5-471bp和OPZ19-512bp回收、克隆和测序,并根据序列信息设计两对SCAR引物SP5和SZ19。利用两对SCAR引物对2种蛙基因组DNA扩增的结果显示:SP5显示了其特异性,在对中国虎纹蛙的扩增中出现了单一SP5-388bp特异片段,而在泰国虎纹蛙中没有扩增产物;SZ19在对2种虎纹蛙的扩增中出均出现了单一条带,但片段大小不同,在中国虎纹蛙中为SZ19-456bp,在泰国虎纹蛙中为SZ19-497bp。3个分子标记都可作为基于RAPD成功转化后的SCAR分子标记对2种虎纹蛙进行鉴定。

中国虎纹蛙与泰国虎纹蛙的遗传多样性比较

本文应用RAPD技术,研究了中国虎纹蛙(Rana tigrina rugulosa)和泰国虎纹蛙(R.tigrina cantor)的种内种间遗传多样性及种质特异性分子标记,结果表明:中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙多态位点比例(P)分别为53.77%和70.79%;遗传多样性指数(H)分别为0.1345和0.1780;种间的遗传相似系数(S)为0.4238,遗传距离(D)为0.6613。两种虎纹蛙遗传多样性都较丰富,但中国虎纹蛙的遗传变异程度较泰国虎纹蛙低。在OPA、OPF、OPP、OPZ几个系列随机引物的扩增中得到了可用于鉴别两种蛙的12条特异性谱带。

虎纹蛙白内障病病原的分离鉴定及其免疫防治

本文报道了海南养殖虎纹蛙白内障病的病原及其免疫学防治方法。对该典型患病个体进行病原分离并鉴定表明 ,被分离出的病原为脑膜炎败血黄杆菌。在所实验的 2 0种抗菌药物中 ,该菌只对万古霉素敏感 ,对头孢哌酮中度敏感 ,而对其他 18种药物均不敏感。通过筛选该病原强毒株制备甲醛灭活疫苗 ,对健康虎纹蛙进行免疫接种后 ,可明显提高其对该病的抵抗能力 ,表明在生产上用免疫学方法防治该病是可行的。

虎纹蛙消化道肥大细胞类胰蛋白酶免疫组化研究

研究采用小鼠抗人肥大细胞类胰蛋白酶单克隆抗体AA1,应用ElivisionTM plus免疫组化染色法对虎纹蛙(Rana tigrina rugulosa)消化道组织中类胰蛋白酶阳性肥大细胞存在的可能性进行研究。研究发现单克隆抗体AAl可与中性缓冲福马林液固定的虎纹蛙组织的肥大细胞获得良好的交叉反应,类胰蛋白酶阳性细胞胞浆染成棕黄色,证实虎纹蛙肥大细胞胞浆颗粒中也存在类胰蛋白酶。虎纹蛙组织中AA1免疫染色阳性细胞的分布,与AB/SO和改良甲苯胺兰染色阳性细胞的分布存在较大的差异:虎纹蛙类胰蛋白酶阳性细胞数量很少,且阳性反应比人胃癌间质肥大细胞弱,主要见于黏膜型肥大细胞(MMC)分布区域,如消化道黏膜上皮下方和固有层,少量分布于肠绒毛基底部及食管腺和胃腺周围。而在结缔组织型肥大细胞(CTMC)分布区域,如消化道黏膜下层结缔组织中却未见类胰蛋白酶阳性细胞。AB/SO和改良甲苯胺兰染色阳性细胞数量多,广泛分布于消化道黏膜固有层、黏膜下层、腺体之间、肌间及外膜结缔组织,说明并不是所有的虎纹蛙肥大细胞都含有类胰蛋白酶。很有可能是虎纹蛙MMC中含有类胰蛋白酶,而CTMC中不含类胰蛋白酶。虎纹蛙类胰蛋白酶阳性细胞数量很少,且阳性反应比人胃癌间质肥大细胞弱,说明虎纹蛙肥大细胞胞浆颗粒类胰蛋白酶含量较少,虎纹蛙属于低等脊椎动物,可能与生物进化水平较低有关,有待进一步研究。

虎纹蛙病毒体外培养及其理化特性

从发病濒死的虎纹蛙(Rana tigrina rugulosa)蝌蚪中分离到一种病毒。在25℃条件下,该病毒能在鲤鱼表皮瘤细胞系(EPC),胖头肌肉细胞系(FHM)和草鱼性腺细胞系(CO)三种鱼类细胞上产生空斑状的细胞病理变化(CPE)。该病毒对氯仿,热(56℃,30min)和酸(pH3)敏感。其体外培养的适合增殖温度范围为20～30℃。 电镜下观察,病毒为对称的二十面体,切面正六边形,对角直径125nm左右。

泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙早期胚胎发育比较研究

比较了泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙在控温条件下的胚胎发育过程。结果表明:两亚种蛙在右鳃封闭期与鳃盖完成期之间有明显的"角质颌出现"的特征,因而在传统分期的基础上增加了一个"角质颌出现期",从而将两者自受精卵开始到鳃盖完成期为止划分为26个时期;两亚种蛙大部分发育时期外形特征基本相同,但八细胞期细胞的排列方式,两亚种蛙神经褶期的神经沟形状、纤毛出现期的神经褶棱高度等均不同;泰国虎纹蛙的发育速度较快,自受精卵期到鳃盖完成期共耗时70.4h,中国虎纹蛙在相同的条件下则需92.5h,但在四细胞期、八细胞期、神经管期和尾芽期,泰国虎纹蛙的发育速度却较中国虎纹蛙慢。

环境因素对虎纹蛙胚胎发育的影响

就温度、盐度、p H值及水中溶氧四个环境因素对虎纹蛙胚胎发育的影响进行了系统研究。结果表明 :其适宜的孵化水温为 2 0～ 30℃ ,在此温度范围内 ,随着温度的升高 ,胚胎发育速度加快 ,水温在 (30± 1)℃时 ,胚胎发育到鳃盖完成期需 58.8h,孵化率为 84 .2 % ;水温 (2 0± 0 .5)℃时 ,需 2 0 3.9h,孵化率为 89.0 % ;水温 (2 5± 1)℃时 ,需时 84 .0 h,孵化率最高 ,达 94 .5%。盐度对虎纹蛙胚胎发育影响很大 ,盐度越高 ,胚胎畸形率越高 ,且发育经历时间越长 ,孵化水体的盐度应在 1.9以下 ,最适宜用淡水孵化。p H过高或过低都对胚胎发育不利 ,孵化水体的 p H值以 6 .5～ 8.5为宜。虎纹蛙胚胎发育的不同阶段对水中溶氧量要求不同 ,在肌肉效应期、鳃血循环期和鳃盖完成期 ,水中溶氧的半致死浓度分别为0 .57mg/ L、1.13mg/ L和 0 .4 0 mg/ L。

虎纹蛙的染色体组型

目的：染色体组型具有物种的特异性，它们在遗传过程中是相对稳定的，研究各种动物的染色体组型，其染色体数目、形态等特征可作为鉴定动物种类的指标。方法：以虎纹蛙（ＲａｎａｔｉｇｒｉｎａｒｕｇｕｌｏｓａＷｉｅｇｍａｎｎ）的骨髓和精巢为材料，制备了虎纹蛙骨髓细胞染色体及精巢生殖细胞减数分裂染色体标本，选择形态完好的中期分裂相进行拍照放大，用常规统计方法测量染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数等。结果：虎纹蛙体细胞染色体数２ｎ＝２６，ＮＦ＝５２，可配成１３对同源染色体，其中５对（Ｎｏｓ．１～５）为大型染色体；８对（Ｎｏｓ．６～１３）为小型染色体。全套染色体可分为Ａ组（Ｎｏ．１）、Ｂ组（Ｎｏｓ，２～５）和Ｃ组（Ｎｏｓ．６～１３）。在Ｎｏ．６的长臂远端区域可见次缢痕。同时精母细胞减数分裂中期Ⅱ显示具有１３个二价体，与体细胞染色体对数相符。结论：该蛙染色体的类型。

虎纹蛙性腺发育的细胞学研究

通过组织切片对虎纹蛙性腺发育过程进行研究，根据其细胞学特征，雌性虎纹蛙的性腺发育过程分为卵原细胞期、初级卵泡期、生长卵泡期和成熟卵泡期；在第一个性周期内，从卵原细胞到成熟卵泡整个发育阶段需要2a。雄性虎纹蛙的生殖细胞成簇排列，性腺发育分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞以及精子形成5个阶段；性成熟期为1a。并报道了虎纹蛙的镶嵌型性腺。

虎纹蛙肢体超常再生和畸变二例

对二例虎纹蛙(Rana tigrina rugulosa)肢体超常再生和畸变进行报道和研究。虎纹蛙肢体超常再生和畸变现象的原因可能是变态发育过程中外界创伤的刺激导致组织增生和超常肢体的出现,也可能因农药的使用和“三废”导致环境污染引起变异的发生和超常肢体的出现。

泽蛙♀×虎纹蛙♂杂种胚胎发育过程中三种酶的同工酶酶谱分析

利用聚丙烯酰胺垂直平板电泳法研究泽蛙♀×虎纹蛙♂杂种及其父母本胚胎发育过程中的酯酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶的同工酶酶谱。结果显示:(1)大多数母体酶带在杂种胚胎发育的初期出现并一直持续到晚期;(2)有些父本酶带在杂种胚胎发育到一定时期(肌肉效应期、鳃循环期)出现;(3)有些父本酶带和一条母本酶带始终不出现在杂种胚胎酶谱中;(4)发育后期有些杂种胚胎的同工酶酶谱出现异常。初步探讨了父母本因素对杂种后代同工酶的影响。

虎纹蛙和金线蛙乳酸脱氢酶同工酶凝胶电泳的比较研究

对虎纹蛙和金线蛙的脑、肝、心脏、骨骼肌四种组织的乳酸脱氢酶同工酶进行电泳分析，结果显示这些酶具有一定的组织特异性，同时在心脏、骨骼肌和肝脏中又表现出一定的种间差异。

虎纹蛙舌肥大细胞组化及免疫组化

应用改良甲苯胺蓝(MTB)、阿尔新蓝-藏红O(AB/SO)、甲基绿-派洛宁(MG-P)、天青Ⅱ-伊红-瑞氏混合液等4种组化染色技术进行染色,并用小鼠抗人肥大细胞类胰蛋白酶单克隆抗体AAl通过ElivisionTM免疫组化染色方法,对虎纹蛙舌头肥大细胞进行染色。结果表明:虎纹蛙舌头中的肥大细胞,大小形态不一。虎纹蛙舌组织中分布有大量肥大细胞,主要分布于固有层的结缔组织中和舌头腺体之间,肌层也可见到大量的肥大细胞,并且有沿血管分布的特点。在用ElivisionTM免疫组化染色方法中,单克隆抗体AAl与虎纹蛙舌头组织中肥大细胞中的类胰蛋白酶有良好的交叉反应。类胰蛋白酶阳性细胞数量很少,分布于舌组织固有层和腺体之间。而人胃癌间质中可见多量类胰蛋白酶阳性细胞。