BRCA2基因与RAD51基因的常见多态位点与乳腺癌的关系研究

目的研究BRCA2基因的N372H和RAD51基因的135G/C位点的多态性与乳腺癌的关系。方法应用变性高效液相色谱和限制酶片段长度多态分析技术,在71例乳腺癌患者和85例正常女性中,对上述两个多态位点的基因频率和基因型频率进行调查和比较。结果在乳腺癌患者中,BRCA2基因的N372H位点的基因型HH的频率显著高于正常对照组(9.9%vs 2.4%,χ2=4.010,P=0.045),但RAD51基因的135G/C位点的多态分布在两组人群中的差异无统计学意义。结论BRCA2基因的N372H位点的基因型HH与乳腺癌相关,可能是中国人群乳腺癌的风险遗传因子。

^(18)氟-氟代脱氧葡萄糖对HepG2肝癌细胞凋亡及rad51基因表达的影响

目的研究18F-FDG对HepG2肝癌细胞凋亡的影响,探讨其作用机制。方法将处于对数生长期的肝癌细胞分为实验组和对照组,以不同浓度18F-FDG处理HepG2肝癌细胞,用MTT法、流式细胞术和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别检测细胞增殖与凋亡、活性氧含量、rad51及p53基因表达的情况。结果 18F-FDG能诱导HepG2肝癌细胞凋亡,抑制其增殖,且随着18F-FDG浓度增大,凋亡细胞增加,活性氧产量增加,p53基因与rad51基因表达增强。结论 18F-FDG能诱导HepG2肝癌细胞凋亡,且凋亡率随药物活度浓度增大而增大。

RNA干扰抑制RAD51基因表达对放射敏感性影响的实验研究

目的:构建针对DNA双链断裂修复基因RAD51的siRNA表达质粒,观察对肝癌细胞株HepG-2放射敏感性的影响。方法:采用基因重组技术,构建针对RAD51基因的干扰质粒pSilencer-1、pSilencer-2、pSilencer-3及对照质粒pSilencer-C,经脂质体转染HepG-2细胞,200μg／mL潮霉素筛选稳定表达的细胞,用Western blot测定RAD51蛋白表达量的改变,用细胞克隆形成实验测定细胞放射敏感性。结果:筛选出稳定转染各组质粒的细胞;转染pSilencer -1、pSilencer-2和pSilencer-3质粒细胞克隆的RAD51蛋白表达量分别为转染pSilencer-C细胞克隆的0．60±0．29、0．36±0．16和0．15±0．09,t值分别为4．101、6．561和8．714,P值分别为0．049、0．003和0．001。pSilencer-C组、pSilencer-2组和pSilencer-3组三组剂量存活曲线的D0值分别为1．55、1．46和1．44,Dq值分别为3．31、3．16和2．82,SF2分别为0．82、0．73和0．67 Gy;与pSilencer-C组相比,pSilencer-2组和pSilencer-3组在2 Gy剂量时的放射增敏比SERSF2分别为1．12和1．23。结论:RNAi抑制RAD51基因的表达,能提高HepG-2细胞的放射敏感性,提示RAD51基因可作为放射增敏治疗的一个潜在靶点。

RAD51 135G/C单核苷酸多态与中国汉族家族性乳腺癌BRCA基因突变频率的分析

目的探讨RAD51135G/C单核苷酸多态与中国汉族家族性乳腺癌人群BRCA基因突变的关系。方法本研究检测了200例汉族家族性乳腺癌先证者的BRCA基因的胚系突变,并对患者的RAD51135G/C单核苷酸多态进行基因型分析。结果在200例先证者中检测到31例BRCA基因的突变,15例发生在BRCA1基因上,16例发生在BRCA2基因上。RAD51次等位基因C的分布频率在BRCA1突变者、BRCA2突变者和无突变者中相似。尽管RAD51135GC/CC在BRCA1突变携带者中呈现出更高的频率,但与BRCA2突变携带者相比,差别无显著意义。结论RAD51135G/C单核苷酸多态不能反映中国汉族乳腺癌人群BRCA基因突变的状态。

家蚕微孢子RAD51基因的克隆、原核表达与体外翻译

从家蚕微孢子 (Nosemabombycis)中通过RT PCR扩增出RAD5 1(DNArepairprotein)基因的 3′端部分序列 ,经5′ RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)后得到全长cDNA序列 ,共 10 0 2bp ,编码 334个氨基酸。虽然用NorthernBlot检测不出mRNA的特异性表达带 ,但用RT -PCR直接扩增出全长cDNA而证实了该基因。该cDNA已作为新基因提交到GenBank数据库中 ,登录号为AF0 3730 5。将该基因在大肠杆菌 (E .coli)中进行表达 ,得到表达量较高的分子量约 37ku的蛋白质 ,经亲和层析纯化后得到较浓的单一蛋白带 ,纯化效果较好。用兔网织红细胞裂解液在体外也翻译出该分子量为 37ku的蛋白质 ,进一步确证了该蛋白。通过BLAST查询GenBank数据库 ,发现它与许多生物体的RAD5

RAD51基因135G/C单核苷酸多态性与男性不育的相关性研究

目的:研究RAD51基因135G/C单核苷酸多态性与男性不育的关系。方法:用PCR-RFLP技术,在255个正常生育男性和271例男性不育患者中,对RAD51基因135G/C单核苷酸多态位点的频率分布进行了分析。结果:在正常男性和男性不育患者组之间,RAD51基因135G/C的等位基因频率和基因型频率均无显著性差异(P值均大于0.05)。结论:RAD51基因135G/C单核苷酸多态性与男性不育的易感性不相关。

RAD51基因G135C和XRCC3基因T241M多态性与卵巢癌的相关性

目的研究RAD51基因G135C多态性和XRCC3基因T241M多态性与卵巢癌的相关性。方法对70例卵巢癌和70例健康对照人群的样本分别进行DNA提取、RAD51基因和XRCC3基因扩增及测序,再结合人群临床资料进行统计学分析。结果 RAD51基因型G/G、G/C和C/C在病例组的分布频率分别为71.4%、20.0%和8.6%,在对照组的分布频率分别为91.4%、8.6%和0。病例组突变型频率显著高于对照组(<0.05)。XRCC3基因T/T、T/M和M/M在病例组的分布频率分别为88.6%、8.6%和2.9%,在对照组的分布频率分别为85.7%、14.3%和0;两组差异无统计学意义(>0.05)。RAD51基因型G/G在卵巢浆液性癌组和黏液性癌组中的分布频率分别为68.0%和80.0%,变异基因型(G/C^+C/C)分别为32.0%和20.0%。RAD51 G135C基因型在不同的卵巢癌组织学类型间的分布频率差异无统计学意义(>0.05)。XRCC3基因T/T在卵巢浆液性癌组和黏液性癌组中的频率分别为92.0%和80.0%,变异基因型(T/M和M/M)分别为8.0%和20.0%。XRCC3基因T241M基因型在不同的卵巢癌组织学类型间的分布频率差异无统计学意义(>0.05)。结论 RAD51基因G135C多态性与卵巢癌发病有相关性,XRCC3基因T241M多态性与卵巢癌易感性无显著相关性。两基因的野生型及突变型与卵巢癌的组织学类型不相关。

RAD51-G135C和XRCC3-C241T单核苷酸多态性与急性髓系白血病发病相关性研究

目的:探讨RAD51-G135C和XRCC3-C241T单核苷酸多态性与急性髓系白血病(AML)发病的相关性。方法:研究分为两组:AML患者组(545例AML患者的外周血样本)和对照组(1 034名与患者无血缘关系的正常人的外周血样本),分别抽提2组基因组DNA,通过Taq Man探针实时荧光定量PCR技术分析RAD51-G135C和XRCC3-C241T基因多态性,并分析两者多态性与急性髓系白血病发病相关性。结果:与对照组相比,RAD51-G135C纯合变异型(CC)可显著增加AML患者的发病风险(OR=3.07),而RAD51-G135C杂合变异型(GC)与AML发病无统计学相关性。XRCC3-C241T纯合变异型(TT)与AML发病尚无统计学相关性,而XRCC3-C241T杂合变异型(CT)却可增加AML患者的发病风险(OR=0.66)。结论:RAD51-G135C纯合变异型和XRCC3-C241T杂合变异型显著增高AML的发病风险,对AML的发病更有预测价值。

alg3、vps1301、rad51基因缺失对粟酒裂殖酵母接合生殖的影响

为探寻alg3、vps1301、rad51基因缺失对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)生长及接合生殖的影响,在25℃条件下,培养野生型和3种基因缺失的粟酒裂殖酵母,统计并分析其生长情况;将野生型和3种基因缺失菌株分别各自交配产孢,分析对比野生型和基因缺失菌株的接合生殖情况.结果显示,生长实验中,25℃条件下,12 h内,野生型菌株、alg3Δ菌株、vps1301Δ菌株和rad51Δ菌株的平均生长速度分别为0.0425、0.0098、0.0193、0.0369 OD_(595)/h.结果提示,粟酒裂殖酵母缺失alg3基因后,其生长速度受影响最大.在细胞接合生殖实验中,3种基因缺失菌株产孢数目都出现异常,其中alg3Δ菌株产孢数与野生型表现出显著差异.同时,alg3基因和vps1301基因缺失后孢子长度与野生型存在极显著差异.结果表明,alg3基因缺失对粟酒裂殖酵母的接合生殖影响最大.综上所述,缺失上述3种基因都对粟酒裂殖酵母的生长和接合生殖有不同程度的影响,其中alg3基因缺失对其影响最严重,其次是vps1301基因,rad51基因对其影响最小.

NQO1C_(609T),RAD51_(G135C)和XRCC3_(C241T)单核苷酸多态性与急性淋巴细胞白血病发病相关性研究

本研究探索NQO1C609T,RAD51G135C和XRCC3C241T单核苷酸多态性与急性淋巴细胞白血病(ALL)发生的关系。对170例ALL患者和458名与患者无血缘关系的正常人,用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析其NQO1C609T,RAD51G135C和XRCC3C241T基因型。结果表明:在单基因水平分析时NQO1C609T,RAD51G135C和XRCC3C241T基因型比例在正常对照和ALL患者之间无统计学差异,提示其单独作用时对ALL发病的影响无统计学意义。当3个基因联合分析时,NQO1C609T和RAD51G135C均为变异型时伴髓系抗原阳性的ALL和伴平衡易位ALL的发病风险增加(OR值分别为5.553和2.618);NQO1C609T纯合变异型时农村儿童ALL的发病风险增加(OR值为2.541)。结论:NQO1C609T、RAD51G135C和XRCC3C241T基因型联合作用可能促进ALL的发病,提示多基因联合分析较单基因对ALL的发病分析可能更有预测意义。

沉默CCND1对肝细胞癌细胞5-氟尿嘧啶耐药性的影响及机制

目的探讨沉默细胞周期蛋白D1基因(CCND1)对肝细胞癌(HCC)细胞(SMMC-7721、HepG2细胞)5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药性的影响及机制。方法常规培养SMMC-7721、HepG2细胞,并随机分别分为HepG2+NC-siRNA组、HepG2+CCND1-siRNA组和SMMC-7721+NC-siRNA组、SMMC-7721+CCND1-siRNA组,分别用靶向CCND1的siRNA(CCND1-siRNA)、阴性对照siRNA(NC-siRNA)转染细胞。转染48 h后取各组细胞分别置于含10μg/mL 5-Fu的培养基中培养48 h。用荧光定量PCR法检测CCND1 mRNA表达,用CCK-8实验检测细胞活力,用流式细胞术检测细胞凋亡率,用Western blotting法检测CCND1、DNA修复相关蛋白[磷酸化组蛋白(γ-H2AX)、同源重组修复蛋白(RAD51)]表达。结果转染后,HepG2+CCND1-siRNA组、SMMC-7721+CCND1-siRNA组CCND1 mRNA、蛋白表达均低于其对照组(HepG2+NC-siRNA组、SMMC-7721+NC-siRNA组),比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。5-Fu暴露下72 h,HepG2+CCND1-siRNA组、SMMC-7721+CCND1-siRNA组细胞活力(OD值)低于其对照组,凋亡率高于其对照组,γ-H2AX蛋白表达高于其对照组,RAD51蛋白表达低于其对照组,比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论沉默CCND1可提高HCC对5-Fu的耐药性,该作用可能与调控DNA修复相关蛋白表达有关。

DNA修复基因Rad51表达调控区结构分析

目的 研究 DNA修复基因 Rad5 1的转录起始区上游序列 ,寻找与其表达有关的调控序列。方法 将待测片段分别克隆入 p GL3报告基因载体 ,用磷酸钙共沉淀法转染 U2 - OS细胞株后测定其荧光素酶活性。结果 转染了含片段 - 96 4～ +14 30和片段 - 733～ +14 30质粒的细胞有较高的荧光素酶活性 ,进一步缩短这两个片段 ,发现转染了含有 - 96 4～ - 4 12、- 74 6～ - 4 12、- 6 5 1～ - 4 12和 - 5 36～ - 4 12片段质粒的细胞均有荧光素酶活性 ,活性大小依次为 - 96 4～ - 4 12、- 6 5 1～ - 4 12、- 74 6～ - 4 12和 - 5 36～ - 4 12。结论 Rad5 1基因的启动子序列可能位于 - 5 36～ - 4 12之间 ,而在序列 - 6 5 1～ - 5 36和 - 96 4～- 74 6之间可能存在着增强子或正转录调节因子的结合位点 ,在 - 74 6～ - 6 5

GSTT1、GSTM1、NQO1、RAD51和XRCC3基因多态性与慢性粒细胞白血病发生关系的研究

目的探讨GSTT1、GSTM1、NQO1、RAD51和XRCC3基因多态性与我国慢性粒细胞白血病(CML)发生遗传易感之间的关系。方法共120例CML患者和458名与患者无血缘关系的正常人,用多重PCR方法检测GSTT1和GSTM1基因型,用PCR-RFLP方法分析RAD51,XRCC3,NQO1基因型。结果CML患者GSTT1和GSTM1缺失型比例分别为50.8%和59.2%,与正常对照组无显著差异(分别为42.8%和53.1%)。CML患者NQO1C/T和T/T基因型的比例(60.0%)、RAD51G135CG/C基因型比例(26.9%)和XRCC3-241Met杂合子缺失型(Thr/Met)的比例(9.2%)均与正常对照组(分别为65.3%,12.4%和9.2%)无统计学差异。结论本研究结果提示GSTT1、GSTM1、NQO1、RAD51和XRCC3基因型与我国CML的发生无显著相关性。

RNA干扰技术失活Rad51基因增加肿瘤细胞放射敏感性的研究

目的研究RNA干扰技术(RNAi)能否失活Rad51基因,从而使肿瘤细胞的放射敏感性增加。方法应用Psilencer U6-1．0质粒为载体在人纤维肉瘤HT1080细胞内表达短链干扰RNA (siRNA)。RNAi效应在蛋白水平用Western blot方法评价；在细胞水平用成克隆分析及放射诱导的凋亡来评价。结果所选3个靶序列均起到失活Rad51的作用,放射诱导的Rad51高表达也能被RNAi抑制。成克隆分析表明实验组存活分数在照射2、4、6、8Gy后,分别是对照组的80．5%、78．6%、69．0%、57．7%(P=0．020)；实验组放射诱导的凋亡在放射后0、6、18、24、48h分别是对照组的1．03、1．43、1．19、1．29、1．33倍(P=0．017)。结论RNAi技术能够使内源性Rad51基因及放射诱导的Rad51高表达失活,从而使人纤维肉瘤HT1080细胞放射敏感性增加；RNAi技术是一种新的研究基因功能和放射增敏的方法。

ATM基因在电离辐射诱导下对BRCA1、RAD51表达的影响

目的探讨60Coγ射线照射前、后,BRCA1、RAD51蛋白在GM、ATM+-AT、AT细胞中的表达。方法应用免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜,观察GM、ATM+-AT、AT细胞在0和10Gy60Coγ射线照射后,BRCA1、RAD51蛋白在上述细胞中的定位及表达并进行定量分析。结果60Coγ射线照射前,BRCA1、RAD51蛋白在GM、ATM+-AT、AT细胞中仅有少量表达并且无共定位表达,其中在AT细胞中表达量最低;10Gy60Coγ射线照射后,BRCA1、RAD51在GM、ATM+-AT、AT细胞中表达量增高,其中GM、ATM+-AT细胞呈现共定位表达,AT细胞无共定位表达;GM、ATM+-AT细胞中BRCA1、RAD51蛋白表达量与AT细胞比较差异有统计学意义(P<0·01);GM细胞中BRCA1、RAD51蛋白表达量与ATM+-AT细胞比较差异也有统计学意义(P<0·01)。结论GM细胞和ATM+-AT细胞中存在ATM基因,ATM在射线等因素诱导下可以激活其下游基因BRCA1、RAD51,并且使这两种蛋白表达或表达量增加并且相互作用,共同完成辐射损伤后的细胞修复;外源性ATM转入正常GM细胞后,由于外源性的ATM基因不能完全弥补内源性的ATM突变基因的功能,对其下游基因Brca1“部分”磷酸化,表现为BRCA1、RAD51蛋白表达量均较GM细胞低。

非小细胞肺癌组织Rad51高表达及其临床意义的研究

目的:探讨同源重组修复因子Rad51蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达情况及其临床意义。方法:将383例经手术完全切除的NSCLC患者的肿瘤组织标本构建成组织芯片,采用免疫组化方法检测Rad51在NSCLC中的表达情况,统计分析Rad51蛋白表达与NSCLC临床病理特征及生存预后的关系。结果:在NSCLC组织中Rad51蛋白表达位于细胞核内,约有29.4%(100/340)的NSCLC表现为Rad51蛋白高表达。Rad51高表达患者的术后生存时间较其他患者明显缩短,中位生存时间为19个月,而Rad51低表达患者为68个月(P<0.0001)。多因素分析发现,Rad51表达水平(P<0.0001)、肿瘤细胞分化程度(P<0.009)、分期(P=0.004)和淋巴结转移状态(P=0.0001)是NSCLC患者完全手术切除后独立的预后因子。分层分析发现,Rad51表达对肺腺癌和鳞癌的预后差异无统计学意义。结论:Rad51表达是NSCLC患者完全手术切除后独立的预后因子。Rad51高表达患者生存时间短可能与肿瘤生物活性高,容易产生放化疗耐受有关。

抑制人RAD51基因表达对人骨肉瘤细胞体内外增殖能力的影响

目的:通过抑制人RAD51修复基因(hRAD51)表达,研究hRAD51对骨肉瘤细胞和裸鼠移植瘤生长的影响。方法:构建hRAD51基因沉默的骨肉瘤细胞株HOS-shA2,利用MTT和克隆形成实验从体外观察hRAD51基因沉默对HOS细胞增殖的影响,FCM法检测抑制hRAD51基因表达后细胞周期的变化情况,裸鼠成瘤实验观察降低hRAD51表达对骨肉瘤移植瘤生长情况的影响。结果:成功构建了hRAD51基因沉默细胞株HOS-shA2;体外实验显示,HOS-shA2细胞的增殖能力较亲本及阴性对照细胞明显降低(P<0.01);FCM法检测结果显示,hRAD51基因沉默后G2/M期细胞比例增多(P<0.01);HOS-shA2细胞的裸鼠移植瘤生长速度缓慢,剥离瘤体质量明显轻于亲本HOS组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:hRAD51在骨肉瘤细胞增殖中发挥重要作用,有望成为肿瘤治疗的新靶点。

RAD51基因135G/C多态与人群发生肺癌的易感性研究

目的 探讨DNA双链断裂修复基因RAD51的5＇-UTR区135G/C多态与我国人群肺癌发病的关联.方法 采用PCR-RFLP技术,检测300对肺癌病例与正常对照RAD51基因135FG/C多态位点的基因型.用SAD9.13软件进行非条件Logistic回归,校正混杂因素的影响,分析该位点变异与肺癌发病的关联.结果 病例及对照组中,皆未检测出135CC基因型.病例组135GC基因型频率显著低于对照组（26.7%比34.7%,P=0.0336）.以携带GG野生基因型个体为参照,携带GC基因型能显著减少个体发生肺癌的危险性（调整优势比=0.72 95%置信区间=0.49～0.98 P=0.042）.结论 RAD51的5＇-UTR区135G/C多态与我国人群肺癌发病存在显著性关联,135C可能是我国人群肺癌发生的一个遗传保护因素.

Rad51基因沉默对铅诱导TK6细胞DNA双链断裂损伤修复的影响

目的研究Rad51基因沉默后对醋酸铅染毒致人淋巴母细胞(TK6细胞)DNA双链断裂损伤的修复作用的影响。方法构建Rad51沉默慢病毒载体及阴性对照,感染对数期TK6细胞,荧光定量PCR和Western blot验证感染效果。运用480μmol/L的醋酸铅染毒TK6细胞24 h(Control组、shRNA-NC组和shRNA-Rad51组),采用免疫荧光法检测TK6细胞的磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)的表达,Western Blot检测TK6细胞的Rad51、BRCA1、53BP1蛋白的表达。结果 shRNA-Rad51组的Rad51 mRNA表达水平和Rad51蛋白表达水平均低于Control组及shRNA-NC组(P <0.01);shRNA-Rad51组的γ-H2AX阳性率为(27.48±1.66)%,与Control组的(14.77±1.21)%及shRNA-NC组的(14.04±1.31)%比较,差异均有统计学意义(P <0.01);shRNA-Rad51组的BRCA1蛋白表达水平为(0.25±0.03),与Control组的(0.55±0.04)及shRNA-NC组的(0.51±0.04)比较,差异均有统计学意义(P <0.01);shRNARad51组的53BP1蛋白表达水平为(3.24±0.27),与Control组的(2.01±0.19)及shRNA-NC组的(2.11±0.17)比较,差异均有统计学意义(P <0.01)。结论 Rad51基因沉默后,TK6细胞HR修复通路受抑制和NHEJ修复通路激活,TK6细胞对铅遗传毒性的敏感性增强。

Pten敲除对Rad51基因表达的影响及其机制

目的研究Pten敲除对Rad51基因表达的影响及其可能的机制。方法采用半定量RT-PCR法和克隆形成试验比较Pten+/+MEFs与Pten-/-MEFs两种细胞中同源重组修复相关基因Rad51mRNA转录水平的差异,并比较两种细胞对辐射敏感性的差异和辐射后Rad51基因mRNA转录水平的差异及其可能的机制。结果与Pten+/+MEFs细胞相比,Pten-/-MEFs细胞中Rad51基因mRNA的转录水平和对辐射的敏感性显著降低;辐射后以及PI3K/AKT信号通路抑制剂LY-294002作用后,Rad51基因mRNA的转录水平明显增高。结论Pten缺失后Rad51基因表达异常,Pten可能通过PI3K/AKT信号通路来调控Rad51基因的表达。