用正交设计优化荔枝RAPD反应体系

以改良CTAB法提取的荔枝基因组DNA为模板,应用L25(56)正交表,研究了Taq、Mg2+、随机引物、dNTPs和DNA模板5种RAPD反应组分浓度变化对扩增结果的影响,量化分析结果表明:正交设计可以应用于RAPD反应体系的建立。用这种方法建立的荔枝RAPD-PCR优化反应体系为:25μL反应体系中含1×Buffer、2.0mmol/LMg2+、2.0UTaqDNA聚合酶、0.15mmol/LdNTPs、0.6μmol/L随机引物、25ngDNA模板。

蜜蜂DNA提取纯化与RAPD反应体系的建立

以意大利蜜蜂为材料,研究了蜜蜂DNA的提取以及对RAPD分析的影响因素,包括模板浓度、Mg2+、dNTP和引物,建立了适于蜜蜂RAPD分析的PCR反应体系,即20μL反应体系中,包括10mmol/LTris-HCl(pH8.3)、50mmol/LKCl、20～60ngDNA、3.0mol/LMgCl2、0.2mmol/LdNTP、0.5μmol/L随机引物和1.5unitTaq聚合酶。扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,40个循环;最后在72℃延伸10min。

柱花草RAPD反应体系的建立及其8个品种遗传多样性分析

采用两种不同的方法分别从柱花草嫩叶及种子萌发芽中提取了高质量的DNA ,并对柱花草RAPD反应中的各组分浓度及热循环因素进行优化 ,建立了柱花草RAPD反应的最佳条件。在此基础上 ,用 2 0条随机引物对 8个柱花草品种进行了RAPD扩增 ,结果表明 ,其多样性达 5 1 .9% ,品种间的遗传相似系数在 0 .5 3～0 .88之间 ;根据非加权成对平均数法 (UPGMA)进行分类 ,获得了品种聚类树形图 ,8个柱花草品种均被明显分开。

山核桃RAPD反应体系的优化

建立山核桃RAPD反应优化体系是进行山核桃遗传多样性分析的前提。通过对影响PCR扩增结果的主要因子的组合研究,确定了山核桃Caryacathayensis的最适反应体系和扩增程序,即在20μL反应体系中,含2 5mg·L-1(50ng)模板,2 0μL10×Buffer,16 67pmol·s-1TaqDNA聚合酶;各0 2mmol·L-1dNTPs,3 0mmol·L-1MgCl2,0 3μmol·L-1引物。扩增程序为:94℃预变性300s,94℃变性30s,38℃退火30s,72℃链延伸90s,38次循环,72℃后延伸420s。

山茶花叶片DNA提取及RAPD反应体系的研究

山茶花（Camellia japonica L.）是我国特产的名贵花卉之一,由于其品种繁多,在系统分类和品种鉴定上存在一定的难度.本研究针对山茶花的DNA提取方法和RAPD扩增体系进行了摸索,旨在为山茶花在DNA水平的分类鉴定和分子生物学方面研究打下一定的基础.实验采用改进的CTAB法提取山茶花叶片DNA,得到的DNA纯度较高,OD260/OD230值为1.90～2.0,OD260/OD280值为1.80～1.83,得率也较高,一般在150～200μg·g-1左右,片段完整性较好,大于20kb,符合分子遗传实验的要求;在山茶花RAPD扩增条件的研究中,发现20μL反应体系中加入100ng DNA、125 μmol·L-1dNTP（each）、1.2μmol·L-1Mg2＋、1×Buffer、0.5μmol·L-1引物、1 U Taq酶最为合适,退火温度一般设为37℃左右,扩增产物的电泳条带数多、清晰、明亮.

黄连药材DNA提取及RAPD反应体系的优化

目的探索黄连药材DNA的提取并对其RAPD反应体系进行优化。方法采用目前较为流行的苯酚法、CTAB法、高盐低pH值法，通过电泳、紫外分光光度仪检测及RAPD扩增效果确定黄连药材基因组DNA提取的最佳方法。结果CTAB法为黄连药材基因组DNA提取的最佳方法，建立了适合黄连药材的RAPD反应体系：25μL体系中内含1×PCR buffer、2mmol／LM g^2＋、100-150μmol／L dNTP、20ng引物、40ng模板、1UTaq酶。结论CTAB法及黄连药材的RAPD反应体系可以用于黄连药材的RAPD分析。

黄麻DNA提取与RAPD反应体系的建立

以假黄麻、假长果、越南圆果 (圆果种黄麻 )等为材料 ,研究了黄麻 DNA的提取方法以及对 RAPD分析的影响因素 ,包括模板浓度、Mg2 + 、d NTP、引物和 Taq酶等 ,建立了适于黄麻种质 RAPD分析的 PCR反应体系 .即在 2 5μL反应体积中 ,Tris- HCl(p H8.0 )、KCl、Mg Cl2 、d NTP、随机引物的浓度分别为 10 mmol· L-1、5 0mmol·L-1、2 .5 mmol· L-1、15 0 μmol· L-1、0 .2 μmol· L-1,并含有 30 - 60 ng DNA与 1.5 U Taq DNA聚合酶 .扩增程序为 :94℃预变性 5 min;然后 94℃ 30 s,37℃ 1.5 min,72℃ 1min,4 1个循环 ;最后 72℃延伸

苜蓿基因组DNA提取和RAPD反应条件优选

采用 CTAB法、N2 — SDS法、SDS法和改进的 CTAB法 ,提取苜蓿基因组 DNA ,比较其分离效果。结果表明 ,改进的 CTAB法为最佳提取法。对 RAPD反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验 ,建立适合苜蓿RAPD分析应用的体系组成为 :反应液总体积 2 5μL ,174ng/μL模板 DNA ,2 .5μL 10 x反应缓冲液 ,10碱基引物浓度 0 .1μm ol/ L ,Taq DNA聚合酶 1U ,d NTP浓度 0 .3 mm ol/ L ,Mg2 + 浓度 2 .5 m mol/ L。 PCR反应循环为 :94℃4min,36℃ 30 s,72℃ 1min;94℃ 30 s,36℃ 30 s,72℃ 1m in,45个循环 ;72℃延伸 10

马槟榔DNA提取及其RAPD反应体系的优化

马槟榔是我国特有的仅分布在热带、亚热带地区的珍稀濒危野生果树,马槟榔种子中所富含的植物甜蛋白马宾灵(Mabinlin)在食品甜味剂领域有着广阔的应用前景。为了对我国马槟榔野生种质资源进行遗传多样性分析,本研究建立并优化了马槟榔基因组DNA的RAPD技术最优反应体系。结果表明,采用SDS-CTAB方法提取的马槟榔基因组DNA满足RAPD试验要求;RAPD最优反应体系(25μL)为:引物的终浓度为1.0μmol/L,dNTPs的终浓度为0.2mmol/L,模板DNA的终浓度为1600ng/L,TaqDNA聚合酶用量为40U/L。本研究通过对马槟榔DNA的提取及RAPD反应体系的优化,旨在为下一步对我国马槟榔野生种质资源进行遗传多样性分析提供基础。

南瓜RAPD分析体系的优化

为确保南瓜RAPD反应结果的稳定性和重复性,对MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq酶含量、引物浓度、模板DNA浓度、复性温度、PCR循环次数等影响南瓜RAPD结果的重要因素进行了初步研究。最终优化的南瓜RAPD反应体系为25μL反应液中:10×反应buffer(100mmol/LTris-HCl,100mmol/LKCl,80mmol/L(NH4)2SO4,pH9.0,NP-40)2.5μL,3mmol/LMgCl2,0.2mmol/LdNTPs,Taq酶l.0U,引物15ng/μL,DNA模板10ng/μL。本研究最终确立的PCR反应程序为:94℃预变性5min,然后按94℃变性30s,37℃退火30s,72℃延伸90s,进行40个循环,最后72℃延伸5min。在此条件下得到的RAPD图谱可为南瓜遗传多样性、分子标记及辅助育种等研究提供有效的手段。

茶树基因组DNA提纯与RAPD反应系统建立

DNA的提取质量是决定RAPD分析成功与否的关键。茶树幼嫩新梢中含有大量的茶多酚等次生物质 ,采用磨样时添加抗酚类氧化褐变的物质 ,在细胞核裂解之前去除细胞质中的茶多酚和蛋白质 ,而后再用改进的DNA微量快速提取法———SDS法分别从不同茶树品种新梢中提取和纯化基因组DNA ,所得到的DNA样品适宜于RAPD反应。通过对茶树RAPD分析中影响扩增结果的因素的研究 ,建立了茶树RAPD的最适反应系统 ,即在 2 5ul反应体系中 ,含 2 0 - 50ng模板DNA ,1 5mmol/lMgCl2 ,各 0 1mmol/lDNTPs ,0 2umol/L引物和 1UTaqDNA聚合酶 ;扩增程序为 :95℃预变性 30 0s ,94℃变性 6 0s,35℃退火 6 0s ,72℃延伸 12 0s ,共进行 4 0个循环 ,最后 72℃延伸 6 0 0s。

烟草RAPD反应体系的建立与优化研究

以烤烟品种为材料,研究了烟草RAPD分析过程中的影响因素,包括模板浓度、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、循环次数、退火温度等,建立了适于烟草RAPD分析的PCR反应体系:即在25μl反应体系中,模板用量为40ng;引物浓度为0.4μM;Mg2+浓度为2.5mM;dNTP浓度为0.2mM;TaqDNA聚合酶用量为1U。扩增程序为94℃预变性5min;然后94℃变性1min,38℃复性1min,72℃延伸1.5min,39个循环;最后72℃延伸5min。

菊属植物RAPD反应体系的建立

在ＲＡＰＤ反应中，有许多因素影响结果的稳定性和准确性．该文选取了菊属６种植物，对ＲＡＰＤ各种反应条件进行了摸索．结果表明：菊属植物较为理想的反应体系为：２０μｌ反应体积含１０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ为８．３），５０ｍｍｏｌ／ｌＫＣｌ，２ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ２，０．００１％ｇｅｌａｔｉｎ，２００μｍｏｌ／ｌｄＮＴＰ，５０～２００ｎｇ引物，０．７５～１．０单位（Ｕ）ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，２～１０ｎｇ基因组ＤＮＡ．在２０个核苷酸引物情况下，反应条件为：９２℃、３ｍｉｎ预变性；９２℃、４５ｓ，５０℃、１ｍｉｎ，７２℃、２ｍｉｎ，循环４０周；最后一次延伸为７２℃、１０ｍｉｎ．应用上述反应体系进行扩增反应，反应产物在２％琼脂糖凝胶上以５Ｖ／ｃｍ电场强度电泳２～４ｈ。

土壤微生物RAPD分析体系的优化研究

采用正交实验设计,对影响土壤微生物RAPD扩增体系的Mg2+、dNTP浓度及引物浓度进行了研究,同时对退火温度、延伸时间及循环次数进行摸索。结果表明,适宜土壤微生物PCR扩增反应在25μl体积中进行,包括7ng土壤微生物DNA样品、20pm随机引物l、.5uTaq酶、3.0mmol.L-1Mg-CL2和0.2mmol.L-1dNTP。PCR扩增反应进程如下:94℃3min,使土壤DNA变性;然后再进行39个循环,每个循环包括94℃1min,37℃40s,72℃90s,结束后72℃延伸7min。

苎麻属植物RAPD反应体系影响因子的研究

以苎麻属植物中的4个种为材料,用SDS和CTAB2种方法提取基因组DNA并比较其RAPD分析的效果;对RAPD反应体系中的一些重要参数进行了优化,建立了适合苎麻属植物RAPD分析的反应体系。即在25μL的反应总体积中Mg2+浓度为1.5mmol/L,dNTPs浓度为0.20mmol/L,40ng模板DNA,Taq酶1.0单位;反应程序为95℃预变性5min;前5个循环为94℃变性1min,36℃结合1min,72℃延伸2min;后40个循环为94℃30s,36℃1min,72℃2min(最后1个循环为10min);共45个循环。该反应体系具有良好的稳定性和重复性。

山羊RAPD反应条件的研究

以贵州山羊为材料 ,研究了MgCl2 浓度、引物浓度、dNTP浓度、模板DNA用量、TaqDNA聚合酶用量对RAPD反应的影响 ,建立了一套适合山羊的最佳RAPD反应体系。反应总体积为 2 5 μl ,MgCl2 浓度 2 .0mmol/L ,引物为 1 8.75ng ,dNTP浓度 0 .32mmol/L ,模板DNA为 1 5ng ,TaqDNA聚合酶为 2U。PCR反应程序为 :94℃ 3min ;94℃ 1min ,38℃ 1min ,72℃ 2min ,40Cycles ;72℃ 1 0min。

梨属植物RAPD反应体系的建立与优化

以鸭梨、杜梨为材料,对梨属植物DNA的提取及RAPD反应体系进行了系统优化,建立了梨属植物最佳反应体系及参数。结果表明,适当提高抗氧化、抗酚类物质的浓度(2%β-巯基乙醇,2%PVP-40,20 mmol/LNa2S2O5),提取的基因组DNA纯度较高;反应体系中含有Mg2+2.0 mmol/L,dNTPs浓度200μmol/L,引物0.4μmol/L,模板DNA 1.6 ng/μL,Taq DNA聚合酶0.06 U/μL,可成功用于梨属植物RAPD扩增。说明改良的CTAB法能成功用于梨属植物DNA提取,建立的最佳反应体系可用于梨属植物RAPD扩增。

茶树RAPD反应系统和扩增程序优化

以龙井43为材料，使用国产PCR仪，对茶树RAPD分析中影响PCR扩增结果的因素进行了研究，确定了茶树RAPD的最适反应系统和扩增程序，即在25μl反应体系中，含25～50ng模板DNA、2mmol／LMgCl2、各0．2mmo／LdNTPs、0．2μmol／L引物和0．5～1．0UTanDNA聚合酶；扩增程序为：94℃预变性180s，94℃变性60s，38℃退火90s，72℃延伸120s，共进行40～45个循环，最后72℃延伸300～600s，这样可以取得较好的扩增结果。

樟树RAPD反应体系的优化

以樟树叶片提取的基因组DNA为材料,对影响其RAPD-PCR各种反应条件的因子进行研究。结果表明:PCR反应时,总反应液20μL中基因组DNA浓度为8 ng/μL,镁离子浓度为2.0 mmol/L,dNTP浓度为0.2 mmol/L,引物浓度为0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/(20μL)时,出现可辨认的鲜明谱带,为RAPD分析应用于樟树遗传多样性研究和良种选择打下良好的基础。

烟草靶斑病菌基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

采用改良的CTAB法,对16个烟草靶斑病菌菌株进行基因组DNA的提取,所得的DNA样品的OD260/OD280值在1.76～1.89之间,电泳主带清晰,无弥散、拖尾现象,DNA质量较高。通过单因素和正交设计结合的方法对影响RAPD-PCR反应的主要因子Mg2+,dNTP,引物的浓度和模板DNA,Taq酶的用量进行了优化,建立了适宜于病菌的RAPD分子标记的最佳反应体系。优化的反应体系为:模板DNA 10 ng,Mg2+浓度3.25 mmol/L,dNTP浓度0.175 mmol/L,Taq酶1.4 U,引物浓度0.5μmol/L,反应体系总体积为25μL。通过该反应体系可以获得清晰、稳定、特异性的分子标记谱带,扩增结果较好。