实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因

本研究旨在建立用实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARa mRNA的方法,探讨APLPML-RARa融合基因表达水平与疗效的关系。用RT-PCR扩增培养的NB4细胞的PML-RARa融合基因,取1μgNB4细胞的总cDNA进行10倍的梯度稀释,作为标准品,建立荧光定量RT-PCR方法,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行了测定。定量检测4例急性早幼粒细胞白血病(APL)患者治疗前后骨髓内PML-RARa融合基因转录本水平,并对1例经治疗完全缓解后又复发的患者PML-RARa转录本水平(拷贝数)进行动态监测。结果表明:用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10-5μgNB4细胞cDNA中的PML-RARa融合基因,其重复性的CT值,管间、批间变异系数(CV)分别为2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PML-RARa基因转录本水平的分别为1884、5533、1803、4677拷贝,平均为3475拷贝。经ATRA+化疗治疗后其PML-RARa基因转录水平下降至40、135、79、229拷贝,平均为121拷贝。还有1例患者治疗前PML-RARa基因转录本水平为8600拷贝,经过4个月治疗,虽然此时患者处于完全缓解期,但其转录水平拷贝数仍有730。3个月后患者出现复发,转录本水平升至为11000拷贝。经过ATRA+化疗治疗后转录本水平又逐渐下降至1200拷贝。结论;建立的实时定量RT-PCR灵敏、重复性好。治疗后APL患者的PML-RARa融合基因转录本水平明显下降,复发时基因转录本水平又升高。融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系一致,这有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后。

PML-RARa融合基因BCR3亚型急性早幼粒细胞白血病的临床研究

目的研究全反式维甲酸(ATRA)联合亚砷酸(ATO)治疗初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)的疗效。方法回顾性分析ATRA联合ATO诱导治疗+序贯巩固化疗+ATO/ATRA维持治疗,对初诊急性早幼粒细胞白血病患者的疗效。并比较在高危组与中低危组间,及不同PML-RARa融合基因亚型组间的疗效差异。结果高危组和中低危组的完全缓解率分别为70.0%和96.9%,差异无统计学意义(P=0.04),3年总生存率(OS)分别为(70.0±14.5)%,(96.9±3.1)%,差异有统计学意义(P=0.01);3年无病生存率(DFS)分别为(66.7%±19.2)%,(93.8±6.1)%,差异无统计学意义(P=0.08);PML-RARa融合基因BCR1亚型组与BCR3亚型组的完全缓解率分别为78.6%和95.6%,差异无统计学意义(P=0.14),3年OS率分别为(95.7±4.3)%,(78.6±11.0)%,差异无统计学意义(P=0.18);DFS率分别为(92.9±6.9)%,(87.5±11.7)%,差异无统计学意义(P=0.24)。结论 ATRA联合亚砷酸作为一线用药治疗初诊急性早幼粒细胞白血病,尤其对于BCR3亚型患者取得了非常好的疗效。

三氧化二砷及全反式维甲酸对白血病NB4细胞PML/RARA融合基因的影响

目的探讨在NB4细胞增殖过程中PML/RARA融合基因表达的情况,并用三氧化二砷(As2O3)和/或全反式维甲酸(All trans retinoic acid,ATRA)干扰后观察目的基因的变化。方法用As2O3(1×106 mol/L)或/和ATRA(1×106 mol/L)干扰体外培养成熟的NB4细胞,后用real/Time PCR检测PML/RARA融合基因的相对表达量。结果ATRA及As2O3均使PML/RARA融合基因表达抑制,但双药联用无明显协同作用(P<0.05)。As2O3对PML/RARA融合基因表达抑制较同剂量ATRA强。结论 ATRA及As2O3均能下调PML/RARA融合基因。As2O3对PML/RARA融合基因的下调作用及对NB4细胞的增殖抑制均比同剂量的ATRA强。双药联用与单药干预,无叠加效应。

微滴式数字PCR技术检测外泌体PML-RARA融合基因的表达

目的:利用微滴式数字PCR技术检测外泌体中PML-RARA融合基因表达水平。方法:使用基于Taqman探针法的ddPCR技术,建立可检测长型和短型PML-RARA融合基因转录本的方法。以PML-RARA阴性细胞株HL-60细胞的RNA逆转录合成的cDNA为阴性对照建立空白检测限(LOB);以表达长型PML-RARA融合基因的NB4细胞RNA逆转录合成的cDNA和含短型PML-RARA cDNA的重组质粒为模板分别确定两者的最低检测限(LOD);并检测NB4细胞培养上清来源的外泌体和急性早幼粒白血病患者血清来源的外泌体中PML-RARA融合基因的表达情况。结果:采用ddPCR技术针对长型和短型PML-RARA转录本测得的LOB分别为每微升PCR反应体系中含0.0725拷贝和0.083拷贝;测得的LOD分别为每微升PCR反应体系中含0.19拷贝和0.21拷贝;使用该检测方法,在NB4细胞培养上清来源的外泌体和急性早幼粒细胞白血病患者血清来源的外泌体中均可检测到PML-RARA融合基因的表达。结论:建立了一种基于ddPCR技术检测融合基因转录本的方法,可对外泌体中的微量PML-RARA转录本进行绝对定量,为无创动态监测急性早幼粒细胞白血病患者血清外泌体中PML-RARA融合基因的表达水平提供了可能。

PML/RARa融合基因监测急性早幼粒细胞白血病微小残留病的临床意义

目的:观察PML/RARa融合基因在监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(MRD)中的临床意义。方法:诱导缓解及巩固维持治疗期间,采用筑巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测患者骨髓细胞中PML-RARa融合基因的动态变化,PML-RARa融合基因。结果:长期随访的18例完全缓解(CR)患者,2例出现分子学复发。其中1例发生于CR1后后4个月,诱导缓解治疗后获得CR2, CR2后2个月再次出现分子学与血液学的复发,诱导治疗1个疗程获得CR3;1例发生于CR1后74个月,诱导缓解治疗后获得CR2,随访结束时生存期已达106个月。结论:在CR期定期监测PML-RARa融合基因,可早期发现分子学复发,及时干预治疗可避免血液学复发。

表型分析在PML-RARA转基因小鼠筛选中的应用

PML-RARA转基因 ( Tg)小鼠发生急性早幼粒细胞白血病 ( APL) ,为深入研究APL 发病机理提供了良好模型。对 Tg小鼠进行定期观察和表型分析 ,结果表明 PML-RARA Tg小鼠经历白血病前期和白血病早期阶段 ,最终发展成典型的终末期白血病 ,证实 Tg小鼠 APL 的发生是一个经历多阶段的渐进过程 ,各阶段具有明确可分的细胞形态学和组织病理学特征性改变。通过对 Tg小鼠进行定期观察并作外周血、骨髓象和组织病理学分析 ,筛选处于 APL不同发病阶段的 Tg小鼠 ,为研究 APL多阶段渐进的发病过程中基因型改变提供了良好的实验依据。

PML/RARa融合基因检测在早幼粒细胞性白血病鉴别诊断中的意义

目的 对MIC分型不能确诊的早幼粒细胞性白血病进行鉴别诊断。方法 应用筑巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PML/RARa融合基因。结果 9例不能完全确诊的患者,5例PML/RARa阳性,另4例结合MIC分型与融合基因结果分别诊断为MDS,CML,M_2,M_2复发。2例长期完全缓解的APL患者,临床和遗传学达缓解,但1例融合基因仍然阳性。结论 利用RT-PCR检测PML/RARa融合基因不但可以用来进行早幼粒细胞性白血病鉴别诊断,而且可以用来供临床选择治疗药物、预后判断、疗效观察以及微量残留白血病细胞检测。

发夹结构DNA探针用于检测白血病PML/RARA融合基因的电化学传感器的研究

基于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）中PML／RARA（promyelocytic leukemia／retinoic acid receptor alpha）融合基因的碱基序列，设计了一种新型发夹结构DNA电化学探针，并将此探针固定在玻碳电极表面，采用自行合成的硝基吖啶酮（NAD）作杂交指示剂，应用循环伏安法与差分脉冲伏安法实现了对人工合成的APLPML／RARA融合基因的检测，同时对检测条件进行优化。结果表明，在pH7．0Tris—HCl缓冲液中，杂交前后NAD氧化峰电流差值与靶标链浓度在2．0×10^-8～1．0×10^-7mol·L^-1范围内呈良好的线性关系，检出限为3．0×10^-9mol·L^-1。

IRF6和RARA基因多态性与非综合征性唇腭裂的相关性研究

目的探讨干扰素调节因子-6(IRF6)基因rs2235371位点和视黄酸受体-α(RARA)基因rs2229773位点单核苷酸多态性(SNP)与非综合征性唇腭裂的关系,以及2个位点在患者和健康者之间的基因型和等位基因型频率差异。方法选取153例非综合征性唇腭裂(NSCL/P)患者作为NSCL/P组,体检健康者150例作为健康对照组。运用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELF)技术,分析IRF6、RARA基因的多态性,比较2组研究对象基因型和等位基因型频率差异。结果 IRF6基因rs2235371位点基因型CC、TT和等位基因C、T频率在NSCL/P组和健康对照组的分布,差异有统计学意义(P<0.05),NSCL/P组等位基因C频率高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。RARA基因rs2229773位点基因型CT、TT频率在NSCL/P组和健康对照组的分布,差异有统计学意义(P<0.05),NSCL/P组基因型为CT杂合子,显著多于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NSCL/P与IRF6基因rs2235371位点等位基因C及RARA基因rs2229773位点CT基因型具有相关性。

三种PML/RARA亚型急性早幼粒细胞白血病临床特点对比分析

目的：分析并比较不同早幼粒细胞白血病／维甲酸受体α融合基因（ PML／RARA）亚型急性早幼粒细胞白血病（ APL）的临床特点。方法收集我中心2010～2014年108例初诊APL患者的临床资料，分析不同PML／RARA亚型的特点。结果最常见的PML／RARA亚型为L型（67例，62．0％），其次为S型（30例，27．8％）、V型（11例，10．2％）。 V型患者合并出血的比例（45．5％）低于L型（74．6％）和S型（86．7％），P均＜0．05；V型患者中位纤维蛋白原水平（1．98 g／L）高于L型（1．18 g／L）和S型（1．05 g／L），P均＜0．05。 S型患者（26．7％）较L型（7．6％）和V型（0）更易伴发FMS样酪氨酸酶3内部串联重复（FLT3／ITD）突变，P均＜0．05。 S型患者CD34表达阳性率（24．1％）高于L型（6．3％）和V型（11．1％），P均＜0．05。高、中、低危组维甲酸综合征发生率分别为56．3％、28．8％、17．5％（ P均＜0．05）。三种PML／RARA亚型维甲酸综合征的发生率差异无统计学意义。结论三种PML／RARA亚型的APL临床特点不尽相同，L型最常见，V型出血发生率较低，S型较易伴FLT3／ITD突变和CD34阳性表达。

PML/RARa阴性伴复杂核型染色体改变的急性早幼粒细胞白血病(APL)一例

急性早幼粒细胞白血病(APL)是急性白血病的一种特殊类型。全反式维甲酸(ATRA)、三氧化二砷相继应用于APL的治疗,使其成为急性髓系白血病中治愈率最高的一个亚型;而PML/RARa阴性伴复杂核型染色体改变的急性髓系白血病M3型则属于高危预后。

三氧化二砷治疗难治复发急性早幼粒细胞白血病的分子生物学疗效观察

目的:观察三氧化二砷(AS_2O_3)治疗难治复发急性早幼粒细胞白血病(APL)的分子生物学疗效。方法:0.1%AS_2O_3注射液静脉滴注,连续28天为一疗程,并动态检测PML-RARa融合基因。结果:15例患者再次分子学完全缓解(CR)13例,CR率为86.7%,随访中2例再次出现PML-RARa融合基因阳性,给予AS_2O_3获得再次CR。结论:AS_2O_3诱导治疗难治复发APL患者分子生物学缓解率高,与化疗交替使用能进一步清除微小残留病。

荧光原位杂交技术在急性早幼粒细胞白血病诊断及治疗中的应用价值

目的探讨FISH法检测PML-RARa融合基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)中的临床应用价值。方法对21例疑诊APL患者应用FISH技术检测PML-RARa融合基因。结果 21例疑诊患者中最后确诊为APL 15例,排除APL 6例。15例APL患者中PML-RARa融合基因阳性14例,PML-RARa融合基因阴性者1例,该患者经最后确诊为APL变异型,经诱导治疗后效果不佳。6例疑诊患者PML-RARa融合基因均为阴性,确诊为急性髓细胞白血病-M2。结论 FISH法检测PML-RARa融合基因敏感、可靠,对APL的确诊及指导治疗有重要价值。

融合基因检测在AML-M_2与AML-M_3鉴别诊断中的价值及其临床意义

本研究对临床形态学上难以分型的急性非淋巴细胞白血病在染色体核型分析及免疫表型分析的基础上,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测了AML-M_3的PML-RARα和AML-M_2的AML_1-Eto两种融合基因的mRNA,并对该两种亚型的鉴别诊断及其实用意义作了初步探讨。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因筛查及实时定量检测平台的建立

目的:针对90%以上的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者表达的PML/RARα融合基因,设计引物及探针。对APL患者进行基因筛查,并构建PML/RARα环形质粒作为标准品,建立APL患者PML/RARα融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,为APL患者的诊治提供分子生物学依据。方法:设计PML/RARα及ABL引物及Taqman探针,对APL患者进行基因筛查。并以PML/RARαL型及S型阳性的APL患者cDNA为模板,应用PCR技术扩增出453bp和550bp基因片段,构建pMD 18TPML/RARα(L)及pMD 18T-PML/RARα(S)标准品。实时荧光定量(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术对该基因转录本水平的变化情况进行监测。结果:成功构建pMD 18T-PML/RARα质粒标准品,应用RQ-PCR技术,以ABL为内参,应用Taqman探针法,对APL患者标本进行检测,技术可行,数据稳定。结论:成功构建APL融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,应用于临床病人的基因诊断,为APL的诊治提供了可靠的分子依据。

急性早幼粒细胞白血病患者诱导治疗中出现分化综合征的多因素分析

目的：分析初诊的急性早幼粒细胞白血病（APL）患者在接受全反式维A酸（ATRA）诱导治疗期间出现分化综合征（DS）影响因素。方法收集2005至2014年间海军总医院血液科初诊APL并接受ATRA联合三氧化二砷（ATO）酸或蒽环类药物诱导治疗的84例患者。根据Frankel描述诊断其中35例出现DS。按照潜在危险因素收集数据，对影响DS发生、发展的危险因素进行单因素分析及logistic多因素回归分析。结果 logistic多因素回归分析显示，患者初诊时白细胞计数及早幼粒细胞白血病-维A酸受体α（PML-RARa）基因分型是影响DS发生的独立危险因素（P＜0.05）。进一步对不同组间外周血白细胞计数及PML-RARa基因分型行χ2检验分析，以排除多因素间相互影响因素，结果显示患者初诊时外周血白细胞及PML-RARa基因分型，两组间差异分析存在统计学意义（P＜0.05）。并对PML-RARa基因分型的长（L）亚型及短（S）亚型行χ^2检验分析，结果显示L亚型早幼粒细胞白血病-α纸A酸变体（PML-RARa）基因对DS的发生有统计学意义（P＜0.05）。结论初诊时外周血白细胞计数较高的患者及PML-RARa基因为L亚型的患者在初期接受维A酸联合诱导化疗时更易出现DS。

急性早幼粒细胞白血病(APL)中t(15;17)染色体易位的分子机制研究

对急性早幼粒细胞白血病(APL)中t(15;17)染色体易位的分子生物学研究显示,17号染色体上的维甲酸受体α(RARA)基因与15号染色体上的PML基因并置,并产生PML-RARA融合基因。我们以前的工作证明APL患者中PML基因断裂点集中于2个有限区域,即PMLbcr 1和PML-bcr 2,二者相距约10kb。本文确定了PML-bcr 1的DNA顺序,并确定了一例APL患者染色体相互易位接合部的基本结构。与以前国外所报道的二例病例进行了比较,发现断裂点可能处于拓扑异构酶Ⅱ裂解位点,由此,我们对t(15;17)中DNA异常重组的机制提出了一个工作模型。

一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的:建立一步法RT-PCR检测APL患者PML-RARα融合基因的实验方法。方法:用特异引物一步法RT-PCR检测PML-RARα融合基因,并作灵敏度试验。结果:本方法的灵敏度可达到1∶103水平。对25例APL患者检测PML-RARα融合基因,阳性率为100%,并可检测出PML-RARα融合基因各种融合方式。结论:一步法RT-PCR检测PML-RARα融合基因有很好的灵敏度和特异性,操作简便、快速,特别适用于临床检测。

一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的建立一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者PML-RARα融合基因的实验方法并作相关性能评价。方法设计两对特异性引物,用一步法RT-PCR法检测APL患者PML-RARα融合基因的三种异构体,并用NB4阳性细胞株做稀释试验,得出该方法的最低检测限;同时对2006年以来华西医院确诊APL患者的PML-RARα融合基因检测和骨髓细胞形态学检查结果进行比较。结果一步法RT-PCR法检测PML-RARα融合基因的灵敏度可达10-4水平;使用两对引物同时扩增,可检出PML-RARα融合基因全部三种异构体;62例经临床和骨髓形态学确诊为APL的患者,其PML-RARα融合基因阳性率为100%。结论一步法RT-PCR检测APL患者PML-RARα融合基因有很好的灵敏度,临床符合度较高且操作简便快速,样本交叉污染可能性小,临床实用性较高。

染色体R显带分析、双色荧光原位杂交及实时荧光定量PCR对于急性早幼粒细胞性白血病诊断价值的评价

目的:评价染色体R显带技术(RT)、双色荧光原位杂交(D-FISH)和荧光定量PCR(RT-PCR)对急性早幼粒细胞白血病(APL)的诊断价值。方法:采用三种方法分析340例疑诊为APL患者的细胞遗传学特征或PML/RARa融合基因,以MICM综合诊断作为APL的诊断"标准",并与三者联合检测比较,评价RT、D-FISH和RT-PCR三者的诊断价值。结果:对于APL的诊断,RT、D-FISH以及RT-PCR三者的敏感度分别为81.3%(78/96),95.0%(91/96)和96.9%(93/96),RT漏检18例,D-FISH的检测结果判断5例假阳性,2例假阴性,RT-PCR的检测结果存在4例假阳性,3例假阴性。三者联合检测的敏感度为99.97%,特异度为100%。结论:三种检测方法单独应用于APL的诊断均存在一定的弊端,三者联合运用有利于提高临床诊断率,同时减少误诊率和漏诊率。