应用RD-PCR技术制备HIV基因芯片探针

利用限制性显示 (RD PCR)技术快速分离HIV 1基因片段制备DNA芯片探针 .以Sau3AⅠ酶切HIV基因 ,得到许多大小适合芯片的限制性酶切片段 .然后在片段两端接上接头 ,根据酶切位点、接头的序列设计通用引物 .在该通用引物的 3′端分别延伸一个碱基后 ,通过引物间的两两组合 ,将PCR反应分成 10个亚组 .纯化各组PCR产物 ,克隆到T载体上 .阳性克隆经鉴定、扩大培养后提取质粒 .以质粒为模板扩增靶片段并进行序列分析 .每个亚型得到了十几个 10 0～ 10 0 0bp的HIV基因片段 .研究表明 ,RD

应用RD-PCR方法制备K562细胞表达谱芯片基因探针

目的收集K562细胞表达谱芯片的基因片段。方法培养K562细胞,抽提其mRNA,反转录为cDNA,应用限制性显示PCR技术(RD-PCR)分离K562细胞不同组别的产物片段,分别行PCR扩增。结果制备了可用于基因芯片制作的基因探针片段。结论RD-PCR方法适合于基因芯片探针的收集。

用RD-PCR技术获取IL-1β作用前后NIT-1细胞的差异表达基因

目的 :获取IL - 1β作用前后NIT - 1细胞的差异表达基因 ,为进行差异基因的克隆和鉴定奠定基础。方法 :利用转基因小鼠胰岛 β细胞系 (NIT - 1) ,通过应用一种改良的筛选差异基因的技术 (RestrictiondisplayPCR ,RD -PCR技术 )筛选cDNA的差异表达条带。结果 :通过对比对照组与实验组凝胶电泳结果 ,找出 79条表达有差异的条带 ,包括实验组出现的新条带和实验组缺失的条带。结论 :应用RD -PCR技术成功分离了IL - 1β作用前后NIT - 1细胞的差异表达条带 ,为大量筛选、克隆与鉴定与 β细胞破坏机制相关的新基因奠定基础 ,有助于了解胰岛素依赖型糖尿病 (IDDM)发病的分子机制。

RD-PCR技术在酵母基因表达谱研究中的应用

目的 应用RD PCR技术分离酵母基因。方法 首先提取酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)总RNA ,纯化mRNA ;然后 ,反转录成双链cDNA ;再用限制性内切酶Sau3AI酶切 ,在酶切片段上加上接头后 ,用通用引物U进行第一次PCR扩增 ,以这一产物为模板用选择性引物(在通用引物的 3’端延伸两个碱基 )作第二次PCR扩增。 5 %PAGE胶分离基因片段 ,选择单带割胶回收 ,做第三次PCR扩增 ,与载体连接 ,最后进行测序分析。结果 采用这种方法分离得到的基因片段 ,经Blast检索分析 ,确为来自酿酒酵母基因的cDNA片段或表达序列标签 (EST)。结论 RD PCR技术可以有效地分离EST ,可用于酵母基因表达调控的研究。

银染RD-PCR方法分离基因片段

从正常培养的SH-SY5Y细胞中提取总RNA,经oligo(dT)纤维素柱纯化分离出mRNA,然后以oligo(dT18)为锚定引物反转录生成单链cDNA再以此为模板合成DNA的第二条链;将双链DNA经Sau3AI酶切之后,接上接头,经通用引物和选择性引物进行扩增;采用5%非变性PAGE胶电泳分离后,用银染的方法显示DNA条带;在直视下回收DNA带,经过扩增后克隆入pMD18-T载体中并鉴定。结果建立了非放射性同位素的银染RD-PCR方法,用于分离基因片段。

应用RD-PCR技术制备基因芯片靶基因片段

应用RD -PCR技术分离SH -SY5Y细胞的基因片段。从正常培养的SH -SY5Y细胞中提取总RNA ,经oligo(dT)纤维素柱纯化分离出mRNA ,然后以oligo(dT1 8)为锚定引物反转录生成单链cDNA ,再以此为模板合成DNA的第二条链 ;将双链DNA经Sau3AI酶切之后 ,接上接头 ,经通用引物和选择性引物进行扩增 ;然后与载体pMD1 8-T相连 ,克隆鉴定、筛选、测序。所分离的cDNA片段经过扩增后用于制备基因芯片的靶基因 ,杂交检测的结果表明 ,此种方法所分离的基因片段可以用于基因芯片的靶基因片段 。

应用RD-PCR技术构建溶藻弧菌的cDNA文库

应用限制性显示PCR(RD-PCR)技术构建溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库,筛选,收集巧妙地解决了由于细菌mRNA poly(A)化位点的高度多态性、用常规方法构建原核cDNA文库所遇到的文库大量重复冗余的难题。并进行筛选、收集cDNA片段进行测序,根据测序结果进行生物信息学分析和结果验证。实验结果表明,我们成功地构建了溶藻弧菌poly (A)化mRNA的cDNA文库,获得一百多个基因片段并对其中53个基因片段进行测序分析,获得了如细菌Ⅲ型分泌系统易位蛋白、趋药性传感器、类丝氨酸蛋白酶等毒力相关因子的基因片断。并且在一定程度上证实了poly(A)化在细菌中不是个别和偶然的现象。实验结果说明了我们所构建的溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库质量高,文库基因片段的重复性低,筛选基因片段效率高、目的性强。本文并探讨了限制性显示PCR技术在细菌poly(A)化mRNA的cDNA1文库构建中的应用价值。

一种限制性cDNA文库的构建

利用本室创建的限制性显示技术RD -PCR ,建立的cDNA文库 ,我们称之为限制性cDNA文库。该方法构建的文库因经过了限制性分组扩增 ,每组均含有特定的cDNA 。

精子细胞中基因表达谱的研究

目的研究成熟精子细胞中的基因表达。方法采用限制性显示PCR(RD-PCR)获得大量正常和异常精子细胞中基因表达序列标签(EST)并以表达谱图的方式显示出来。结果通过RD-PCR技术得到大量正常精子细胞和异常精子细胞的EST及部分差异表达EST。结论RD-PCR技术既能针对已知基因又能针对未知基因,快速收集大量长度适宜、大小均一、适于芯片制备的EST,较通过cDNA文库等方法得到靶基因片段具有独特的优势。关键词:精子;基因表达谱;

60mer长寡核苷酸微阵列构建的优化

目的 优化长寡核苷酸芯片方阵的构建。方法 采用4种不同玻片表面,4种点样液溶解经设计高度特异性探针,制备长寡核苷酸芯片。样品经RD -梯度PCR扩增标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果 点样液3×SSC与丙烯酰胺聚合物表面(国产玻片)联合使用杂交效果最佳。结论 该研究优化了长寡核苷酸芯片微阵列的构建,为芯片的下游技术发展提供支持。

应用限制性差异显示技术制备实验用DNA标记物

目的 建立实验室用DNA标记物。方法 依据PCR引物设计软件Oligo5设计通用引物 ,对质粒DNA进行PCR。结果 通过PCR反应 ,电泳后可见清晰的DNA条带 ,将已确定长度的DNA片段再进行PCR反应 ,与商用DNA标记物进行比较显示 ,用此法制备的DNA标记物可以作为实验室进行凝胶电泳的DNA标记物。结论 采用限制性差异显示技术制备DNA标记物 ,不仅操作简便、快捷、提高工作效益 ,且大大降低费用 。

利用RD技术对HCV-1b基因片段的克隆与分析

目的 :利用限制性显示 (RD)技术对丙型肝炎病毒 1b亚型 (HCV 1b)基因片段进行克隆与分析。方法 :用限制性内切酶Sau3AⅠ消化HCV 1bcDNA ,所得的限制性内切酶片段物进行RD PCR扩增 ,扩增后的产物克隆至 pMD18 T载体并进行快速鉴定。 结果 :得到 2 0个大小均一 (2 0 0～ 10 0 0bp)的限制性片段 ,测序结果表明 ,属于HCV 1b基因。结论 :RD技术能快速收集大量长度适宜、大小相对均一的病毒基因片段 。

应用70mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法酵母经常规培养,抽提mRNA逆转录成cDNA后,经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段,根据目的基因SSA1设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记,与oligo阵列杂交,洗脱,扫描。然后进行杂交后剥除,收集剥除液,采用限制性通用引物扩增,产物克隆于PUC18T载体中,并转化至JM109大肠杆菌中培养,抽提质粒,进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明,用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因,而无需构建cDNA文库。另外,本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。

K562细胞经氯化高铁血红素诱导后分化相关基因的筛选

目的 研究K5 6 2细胞经氯化高铁血红素 (Hemin)诱导后在cDNA分子水平上的表达差异。 方法用限制性显示 (RD PCR)方法寻找K5 6 2细胞在经Hemin诱导后的cDNA差异表达片段。 结果 筛选到差异表达片段 4条 ,并进行了序列测定与同源性分析。 结论 K5 6 2细胞分化是多基因参与的结果 ,这些分化相关基因的共同作用使K5 6

纯化探针降低基因芯片杂交结果的背景

研究探针的纯化对基因芯片杂交结果的影响。将乙醇沉淀的探针和用DNA纯化试剂盒纯化的探针分别与基因芯片杂交 ,在同等条件下进行杂交后清洗和芯片扫描检测。结果表明 ,纯化的探针与基因芯片杂交结果的背景低 ,而未纯化的探针背景强 ,阳性信号界限比较模糊。运用基因芯片进行基因表达谱研究 ,要求杂交检测的结果必须低背景。

SARS冠状病毒检测60mer寡核苷酸基因芯片的设计及应用

目的 设计并应用60 mer寡核苷酸基因芯片实现对SARS冠状病毒的检测。方法 根据寡核苷酸基因芯片的设计原则设计出3O条60mer的寡核苷酸片段,覆盖SARS冠状病毒(以TOR2株为参考序列,GENEBANK索取号:AY274119)全基因组,点样制备成12×12的寡核苷酸基因芯片,将临床诊断SARS患者痰液标本抽提病毒RNA,采用限制性显示技术进行标记,将标记好的样品与芯片杂交,洗脱,扫描。初步探索寡核苷酸芯片诊断SARS冠状病毒的敏感性及特异性,并对芯片做进一步的优化。结果 来自SARS患者样品与芯片上的多个SARS探针杂交,出现了明显的荧光信号;阴性和空白对照探针上没有杂交信号,而对照样品仅与一个SARS探针有杂交。结论 采用60 mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对SARS冠状病毒多段序列的平行检测,对于提高检出率有一定意义,此外,尚可用于监测在发病过程的各个阶段中病毒基因的活动状况。

应用rDNA ITS2区段基因序列分析对浙江省传疟媒介的鉴定

目的对浙江省传疟媒介种类进行鉴定,以指导疟疾防治工作。方法针对媒介按蚊核糖体核酸内转录间隔2(rDNAITS2)区段基因特征,应用PCR基因鉴别技术,对浙江省现场捕捉的按蚊与嗜人按蚊、八代按蚊、中华按蚊、雷氏按蚊实验室标本进行基因鉴别和比较。结果浙江省现场捕捉的按蚊DNA样本的PCR扩增产物均为250bp,与实验室中华按蚊标本一致。结论中华按蚊目前仍是浙江省的主要传疟媒介,现场调查未发现嗜人按蚊。

限制性差异显示RT-PCR技术对大鼠脑缺血相关基因表达的研究

目的研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血与非缺血组织中基因表达的差异,以及差异表达基因随时间变化的规律,为临床寻找新的防治脑缺血的靶点奠定基础。方法采用线栓法制备大鼠不同时间脑缺血动物模型,采用限制性差异显示RTPCR技术(restrictiondisplayRTPCR,RDRTPCR),研究在大鼠局灶性脑缺血过程中差异基因的表达。结果在缺血后各时间点分别出现上调的EST片段有32条、下调的有13条。其中7条在缺血0.5、1.0、4.0小时均出现变化,分别系同一对引物所扩增且分子量相同,其在脑缺血中的表达具有一定的规律性。结论利用RDRTPCR技术成功获取了大鼠脑缺血过程中差异表达的基因,并揭示了部分基因在脑缺血过程中呈现的规律性变化,为进一步筛选、鉴定与克隆表达这些与脑缺血密切相关的基因,阐明脑缺血发病机制奠定基础。

大肠杆菌poly(A)化mRNA基因的芯片制备

利用大肠杆菌mRNA中存在的一定程度的poly (A)现象 ,利用oligo (dT)与poly(A)特异结合的特性 ,纯化并逆转录mRNA ,并应用RD PCR方法获得了 1 70多条大肠杆菌poly (A)化mRNA的基因片段 ,利用这些片段打印成基因芯片 ,以供后续大肠杆菌的基因表达研究。

HPV病毒检测分型芯片的研制和优化

研制和优化寡核苷酸芯片以初步实现对多种常见HPV（Human papillomavirus）病毒的分型检测．应用生物学软件对四型常见HPV病毒（6、11、16、18型）的全基因组序列进行分析，设计具有型特异性、熔解温度（Tm）相近的-60mer寡核苷酸探针，对玻片片基进行优化处理后，点样制备成寡核苷酸基因芯片．将含HPV全长基因序列的质粒作为阳性标准品，利用梯度限制性荧光标记技术对其进行荧光标记，标记好的样品与芯片杂交．结果显示HPV样品与相应的型特异性探针杂交有明显的荧光信号，而与阴性对照探针和空白对照探针没有杂交信号．通过对芯片片基处理和样品荧光标记方法的优化，可以提高芯片检测的杂交特异性和荧光信号强度．