稻瘟病菌限制酶介导整合(REMI)转化的致病性诱变

应用提高真菌转化率的技术———限制酶介导整合 (restrictionenzymemediatedintegration ,REMI)技术转化稻瘟病菌株Magnaporthegrisea131原生质体 ,在限制酶HindIII,KpnI或SacI介导下转化效率分别提高 6 .5、10、3.7倍 .通过 30 0 μg/mL潮霉素筛选获得 10 0 0个以上转化子 .用突变体接种水稻鉴别品种 ,发现其中M2 5和M36与M131比较其致病性发生了改变 .另外还发现产孢缺陷型突变体和培养性状发生改变的突变菌株 .rep

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50μg·mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。

高产纤维素酶木霉REMI突变株的构建与筛选

利用限制性内切酶介导的基因整合技术(REMI)转化T.koningii CICC 40144,共获得23个稳定的突变株。PCR检测结果表明质粒pV2已成功导入突变株中。此外,从已获得的木霉REMI突变株(178个T.atroviride T23的突变株、64个T.koningii T30的突变株和23个T.koningii CICC 40144的突变株)中筛选具有高纤维素酶活性的突变株,其中明显高于出发菌的菌株10余株(TK-2R-3、TK-2R-9、TK-2R-11、TK-2R-14、T30-B3、T30-C7、T23-A2H等)。研究发现出发菌纤维素酶活越高,其突变株纤维素酶活提高幅度越小。筛选获得了1株高产纤维素酶木霉突变株TK-2R-14,其CX酶活达37.6 U·mL-1,比出发菌提高8.05%,FPA酶活达16.9 U·mL-1,比出发菌提高19.01%。

REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化

为了构建限制性内切酶介导的整合(REMI)技术介导的红曲霉(Monascus anka)遗传转化系统,以潮霉素B作为抗性筛选标记,pBC-Hygro、pCB1003、pAN7-1作为转化质粒,采用REMI技术转化红曲霉。结果表明,用REMI技术介导红曲霉转化时,质粒pBC-Hygro和pCB1003适合于红曲霉的转化。环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别;在用REMI技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化;原生质体浓度为1×107～1×108个/mL时,每微克质粒可获得的潮霉素B抗性转化子为2800～3200个;HindⅢ介导转化时的最佳酶用量为105～120U;在质粒用量为8μg/100μL时转化率最高。

康氏木霉REMI突变株的差异表达蛋白分析(简报)

纤维素占植物干重的35％-50％，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。因此，产纤维素酶微生物的基因工程改造技术受到很大关注，成为当前研究热点之一。

REMI及其相关技术在丝状真菌基因克隆中的应用

综述了一种用于转化丝状真菌、标记目的基因的新技术———限制酶介导的整合 (REMI)。着重介绍REMI及其原理、优缺点、质粒的构建特点。以应用实例为例阐述了REMI及其相关技术的操作步骤。

三种捕食线虫真菌的REMI转化

采用REMI(restriction enzyme-mediated integration)技术,成功地用潮霉素磷酸转移酶基因(hygB)转化了捕食线虫真菌白色单顶孢(Monacrosporium candidum)、球状单顶孢(M. sphaeroides)和蠕虫节丛孢(Arthrobotrys vermicola)。这三种菌的转化率分别为10~18、25~35和0.2~3个转化子/μg DNA;它们的转化子的潮霉素抗性稳定性分别为12.5%、82.5%和87.5%。三种菌的野生型的生长在含有150μg/ml潮霉素的PDA培养基上完全被抑制,而它们的转化子一般都能在含有700μg/ml潮霉素的PDA培养基上正常生长。从每种菌中随机选择了40个转化子,在生长速率、菌丝形态、捕器形态及对线虫的捕食能力方面与野生型进行了比较,没有发现有明显差异。

ReMIS:面向再制造信息共享的P2P网络模型

针对当前再制造生产的特点和实际需求,设计了一种面向再制造信息共享的P2P网络模型ReMIS。为适应再制造网络的高度动态性,模型采用基于自然簇和主题簇构成的两层混合结构,上层由主题对等体组成结构化的主题网络,下层由普通对等体组成P2P网络。ReMIS采用基于主题簇的资源分类和检索机制,能够确保在处理海量再制造资源信息的检索请求时具有较高的路由性能和查询性能,并能减少再制造生产中的词汇语义冲突;同时,发布/订阅机制的应用使再制造企业获取实时信息成为可能。相关性能分析表明,ReMIS网络是高效可行的,可以适应再制造生产系统的实际需求。

玉米弯孢叶斑病菌REMI白化突变体的筛选与致病性测定

旨在探讨玉米弯孢叶斑病菌致病机制及遗传变异特性,利用限制性内切酶介导的基因整合技术(REMI)对Curvularia lunata进行了遗传转化,共获得109个稳定的突变株。PCR检测结果表明,质粒p UC-JS已成功导入突变株中,转化子既有单拷贝也有多拷贝,白化菌株单拷贝插入频率为40%。此外,白化玉米弯孢叶斑病菌REMI突变株菌落颜色与野生菌株差异明显,并且在致病性上也明显弱于野生菌株;质粒拯救、测序与blast分析推测插入可能导致FAD3基因功能丧失。

木霉菌及其REMI突变株与油菜联合吸附镉污染土壤研究

研究从木霉菌及其REMI(限制性内切酶介导的基因整合)突变株中,筛选对重金属镉具有较高耐受性和吸附能力的菌株,将其处理油菜品种沪油20,分析油菜与木霉菌联合吸收土壤中镉的效应。测量在镉胁迫条件下,不同木霉菌株与沪油20组合在株高、干重、相对生物量及镉净化率的变化。结果表明:在没有镉处理土壤条件下,野生菌T23可明显促进沪油20的生长,而在土壤有镉的胁迫条件下,突变株P6、H6可明显提高沪油20对土壤镉的净化率。

稻瘟病菌REMI突变体的筛选和鉴定

利用构建的含潮霉素(HygB)抗性标记的质粒pUCATPH在稻瘟病菌菌株M 131中建立一个转化体系,通过限制酶介导整合(REM I)插入诱变技术,以HygB抗性作为突变体筛选标记,获得639个转化子。对其中200个转化子进行表型和致病性测定后,通过点杂交鉴定分别获得6个致病性突变菌株和部分表型突变菌株。对2个表型突变菌株和rep-PCR图谱差异性较大的2个致病性突变菌株进行RFLP分析,结果表明:突变体中均已插入质粒,但转化质粒在M 131中整合具有一定的随机性。

木霉REMI转化体耐热机理的初步研究

本文利用蛋白质电泳、基因克隆和荧光定量PCR等技术对耐高温木霉REMI转化体的抗逆机理进行了初步研究。结果表明,耐高温木霉REMI转化体的蛋白质谱带明显多于出发菌株T21,且差异主要集中在Rf值大于0.593的区域,该区域主要是小分子的热休克蛋白,说明影响耐高温木霉REMI转化体对温度耐受性的蛋白主要以小分子量蛋白质为主。对其中一种热休克蛋白HSP24的基因进行克隆、测序,结果表明不同木霉REMI转化体和出发菌株T21间该基因序列没有差异,但经荧光定量PCR对HSP24基因转录检测表明,耐高温木霉REMI转化体的热激蛋白HSP24的表达量有所增加,从而表明REMI插入提高了该基因的转录水平。

木霉REMI突变株主要生防酶活性改变及其基因部分序列差异的研究

本文探讨了来源于同一出发菌株木霉T21的不同木霉REMI突变株的主要生防酶活性的改变及其基因部分序列的差异,利用生化技术测定了木霉几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶酶活性,并对这两种酶的基因部分序列进行了分析。结果表明,木霉REMI突变株几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性变化较大;相对于出发菌株T21,菌株Ttrm68和Ttrm31酶活性极显著高于出发菌株T21,而Ttrm94则极显著低于T21。采用简并引物克隆几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的部分序列,发现菌株Ttrm68、Ttrm31在几丁质酶基因中插入了GGTATCGATATCGAC片段,菌株Ttrm94在β-1,3-葡聚糖酶基因中插入了GTC片段。

番茄灰霉病菌作用方式不同木霉菌REMI突变株生物学特性的研究

以木霉菌出发菌株T21及作用方式不同木霉菌REMI突变株为试材,研究了对番茄灰霉病菌作用方式不同木霉菌突变株间孢子萌发和产孢能力的差异以及对不同温度、pH值的适应性和对碳氮源的利用能力。结果表明:突变株Ttrm68孢子萌发率最高,为98%;突变株Ttrm25产孢能力最强,极显著高于出发菌株T21。不同木霉菌突变株对温度适应性有所改变,菌株Ttrm68表现出耐高温,在温度高达40℃时仍能生长。不同木霉菌突变株在不同pH值下的培养性状和产孢情况有所改变,菌株Ttrm68在碱性条件下能产厚垣孢子。不同木霉菌突变株对不同碳氮源的利用能力改变较大,菌株Ttrm68能够充分利用各种碳氮源,生长速度最快。

木霉菌REMI转化子解磷筛选及其解磷效果分析

[目的]为了获得具有防病和解磷双重功能的木霉菌REMI转化子。[方法]从康氏木霉菌(Trichoderma koningii)T30及其60株REMI(限制性内切酶介导的基因整合技术)转化子中筛选出3株解磷作用较好的转化子,并研究不同碳、氮源对转化子TK!46解磷作用的影响。[结果]结果表明,碳源对转化子解磷能力影响较小,而氮源的作用较大,其中转化子在解磷过程中最适氮源是氨态氮。[结论]该研究为研制多功能木霉剂奠定了基础,但完全揭示木霉菌解磷机理仍需进一步研究。

甘蓝枯萎病菌REMI转化体系的建立

建立高效、稳定的甘蓝枯萎病菌REMI转化体系,为进一步获得特定表型突变体及基因功能研究建立技术储备。利用REMI(restriction enzyme mediate intergration)转化方法,将线性化的含有潮霉素抗性基因的pUCAT-PH质粒转化甘蓝枯萎病菌A6菌株的原生质体,摸索获得转化子最适的潮霉素筛选浓度以及不同限制性内切酶和酶量对转化效率的影响;利用PCR(polymerase chain reaction)技术对潮霉素抗性转化子进行验证。结果表明转化子的最适潮霉素筛选浓度为50μg/mL;转化效率较高的限制性内切酶为HindⅢ,并且转化效率最高时的酶量为20U。利用该转化体系构建了含1 050个转化子的甘蓝枯萎病菌转化子库,对转化子进行Southern验证,证明该转化体系是可行的。

关于建立房地产管理信息系统（REMIS）的探讨

REMIS是实现房地产管理现代化的重要手段，在目前条件下以GIS软硬件为基础，通过二次开发建立REMIS应是一种首选方案，但是由于房地产管理有其自身特点，REMIS的技术关键应是数据采集与数据质量控制技术与方法，数据模型与数据结构研究，模型库的开发，空间数据库的维护与管理以及面向对象等新技术的应用。

木霉菌REMI转化体对番茄灰霉病的防治及其机理的研究

研究不同木霉菌转化体对番茄灰霉病防治效果及机理,为木霉菌生物防治的合理利用奠定基础。利用限制性内切酶介导基因整合技术(restriction enzyme-mediated integration,REMI),通过插入线性化质粒DNA获得了生物防治番茄灰霉病(Botrytis cinerea)效果优于出发菌T21菌株(出发菌)的3个木霉菌转化体Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55,对侵染花器和叶片的灰霉病防效分别比原生物防治木霉菌株提高了16.9%和8%。木霉菌转化体的产孢能力、分生孢子的萌发率、对碳氮源的利用能力及对高温的抵抗能力都有所提高;木霉菌转化体本身产生的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性均比出发菌高,因此通过REMI技术可以获得新的有益木霉菌转化体,在一定程度上提高了生物菌株防治番茄灰霉病的水平。说明REMI技术可以用于改良生防木霉菌株的功能,提高生物防治效果。

REMI介导电转化产甘油假丝酵母

为了分离耐高渗和甘油代谢相关基因,以Zeocin为选择标记,利用REMI技术电转化产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes。考察了7种限制性内切酶对转化的影响,选择HindIII进一步优化了转化的几个条件。结果表明,在OD600≈1.3时收集细胞,在1.5kV电压下,感受态细胞浓度为2.0×109个细胞/mL,100U Hind III时,能获得129个转化子/μgDNA的较高转化率,58%的转化子稳定,表明REMI技术适合于产甘油假丝酵母的转化。

稻瘟病菌致病突变体的REMI诱变与鉴定

以水稻“爱知旭”（Ａｉｃｈｉａｓｈａｈｉ）为寄主，将带选择标记的质粒ｐＣＳＮ４３和ｐＢＦ１０１为外源ＤＮＡ，利用限制酶诱导整合（ＲＥＭＩ）这种新方法转化稻瘟病菌原生质体，从筛选到的数百个转化体中分离出３个与致病能力密切相关的突变体Ｒ２Ｈ６５、Ｒ２Ｈ６９和Ｒ２Ｂ１５６５。其中，Ｒ２Ｈ６５和Ｒ２Ｈ６９只产生畸形分生孢子，分生孢子的发育和附着胞的形成以及黑色素的合成均受到极大影响，致病性测试证明完全丧失致病能力；Ｒ２Ｂ１５６５的许多表型与野生型的相似，但致病能力却大大降低。