SYBR Green实时定量PCR检测人原发脑胶质瘤中REV3和REV7基因的表达

目的运用实时定量PCR检测跨损伤修复基因REV3和REV7在人脑原发脑胶质瘤组织中的表达水平,探讨其和肿瘤级别之间的关系。方法采用SYBR Green实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测跨损伤修复基因REV3和REV7的mRNA在85例原发胶质瘤(Ⅱ级20例、Ⅲ级20例和Ⅳ级45例)和14例正常脑组织中的表达水平,统计学分析表达水平和肿瘤级别之间的关系。结果与正常组织相比,REV3和REV7在各病理级别胶质瘤中均表达上调(P<0.05);并且REV3在Ⅳ级胶质瘤中的表达比在Ⅱ级和Ⅲ级中都要高(P<0.05)。秩相关分析表明:REV3的表达量与胶质瘤病理分级呈正相关性(r=0.454,P<0.001)。结论REV3和REV7在胶质瘤组织中均高表达,而且REV3表达水平和恶性程度有密切联系。

沉默REV7联合奥沙利铂诱导人结肠癌细胞THC 8307凋亡的研究

目的探讨抗肿瘤药物奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)联合沉默REV7基因对人结肠癌细胞THC8307细胞凋亡的影响。方法体外培养人结肠癌细胞株THC8307,将REV7基因的特异性siRNA片段转染THC8307细胞,运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot法检测转染后细胞中REV7 mRNA和蛋白表达;运用MTT方法确定L-OHP对THC8307细胞的半数抑制浓度,实验分为不作任何处理的THC8307组、加药处理的L-OHP组,药物联合REV7 siRNA处理的L-OHP+REV7 siRNA组,采用细胞免疫荧光法检测THC8307细胞Bax、BCL-2的表达定位;采用流式细胞术(FCM)测定各组细胞凋亡率;Western blot法检测各组细胞Bax、BCL-2蛋白表达水平。结果与空白对照组相比,流式细胞术结果显示L-OHP、L-OHP联合REV7 siRNA组均能促进THC8307细胞凋亡,Western blot结果显示,L-OHP、L-OHP联合REV7 siRNA可明显下调凋亡因子BCL-2、上调Bax的蛋白表达水平、BCL-2/Bax灰度比值显著性下降(P<0.05),同时L-OHP、L-OHP联合REV7 siRNA两组相比较,后者较单独L-OHP组对THC8307细胞促进凋亡作用更加显著(P均<0.05)。结论 L-OHP联合沉默REV7基因可显著性地诱导人结肠癌细胞THC8307凋亡,发挥抗肿瘤作用。

跨损伤合成DNA聚合酶ζ-Rev7在肿瘤发展中的研究进展

跨损伤DNA合成(TLS)属于一种复制后修复过程,主要涉及DNA聚合酶κ、η和ζ等。跨损伤修复是细胞内一种DNA损伤耐受机制,DNA聚合酶ζ在这一过程中扮演着重要的角色,DNA聚合酶ζ主要由亚基Rev7和Rev3构成,在细胞代谢中的作用主要是参与跨损伤修复。Rev7(也称为MAD2L2)是一种多功能蛋白,能够与多种蛋白结合,参与DNA损伤修复、细胞的周期调节、基因表达和致癌作用。同时也参与调控多种不良肿瘤的预后过程。

REV7基因对人结肠癌细胞周期及凋亡的影响

目的探讨下调REV7基因对人结肠癌细胞HCT116、SW620细胞周期及凋亡的影响。方法通过体外培养人结肠癌细胞株HCT116、SW620,用REV7基因的特异性si RNA片段转染细胞,运用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹技术检测转染后细胞系的REV7基因干扰效率。选择REV7低表达具有统计学意义的上述细胞系作为实验组细胞,同时将加入转染试剂的HCT116、SW620细胞作为空白对照组,转染阴性RNA oligo干扰片段的HCT116、SW620细胞作为阴性对照组。采用流式细胞术测定各组细胞的细胞凋亡情况。通过Western blot法检测各组细胞抑癌蛋白P53、细胞周期蛋白P21、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4、细胞凋亡蛋白BAK、BCL-XL表达水平。结果实时荧光定量PCR结果显示,HCT116、SW620细胞中si REV7干扰效率均高于60%(P<0.01);Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡结果显示,实验组与阴性对照相比,REV7下调促进HCT116、SW620细胞凋亡(P<0.05);Western blot结果显示,低表达REV7可下调HCT116、SW620细胞抗凋亡蛋白BCL-XL、细胞周期蛋白P21蛋白表达水平(P<0.01),上调促凋亡蛋白BAK、肿瘤抑制蛋白P53、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4蛋白表达水平(P<0.01)。结论下调REV7可以阻滞结肠癌细胞HCT116、SW620细胞周期并促进细胞凋亡,其机制可能与下调REV7后,引起抑癌蛋白P53、蛋白细胞周期蛋白CDK4、P21及细胞凋亡蛋白的BAK、BCL-XL的表达变化有关。

下调REV7基因对于人结肠癌HCT116细胞放射敏感性影响及机制研究

目的研究下调REV7基因表达对人结肠癌HCT116细胞放射敏感性影响及其机制。方法对HCT116细胞进行培养并运用RNA干扰技术实现REV7基因下调,将细胞分为空白组、转染阴性RNA oligo片段阴性对照组、转染REV7 RNA oligo的REV7基因下调组。克隆形成实验反映细胞增殖水平,蛋白印迹法检测相关基因表达水平、细胞凋亡发生水平和非同源末端连接途径发生水平。结果6Gy照后REV7 siRNA组细胞克隆形成率降低(P<0.05)。REV7 siRNA组REV7基因下调效率>60%。REV7 siRNA组γH2AX、Caspase9表达升高(P<0.05),Ku80、XRCC4表达降低(P<0.05)。结论下调REV7基因能提高HCT116细胞放射敏感性,其机制可能与下调REV7后非同源末端连接的发生被削弱有关。