利用PCR-RFLP方法快速鉴别中国牛蒡属药用植物

目的随着近十几年来国内学者对牛蒡属药用植物研究的深入,中国牛蒡属植物鉴定需要一种快速、准确的分子鉴别手段。因此研究拟通过利用聚合酶链式反应-限制性酶切长度多态性(polymerase chain reaction restriction frag-ment length polymorphism,PCR-RFLP)建立一种快速鉴定中国牛蒡属药用植物的方法。方法通过对两种中国牛蒡属药用植物牛蒡与毛头牛蒡常用鉴定DNA条形码进行限制性核酸内切酶图谱分析,找到牛蒡在内源转录间隔区1(internal transcribed spacer-1,ITS1)片段中有一个单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism,SNP)位点,正好为BsaAⅠ酶(YAC/GTR)的酶切位点,根据该酶切位点,设计引物对目标片段进行扩增。另外建立PCR体系:95℃预变性5min,循环反应40次(90℃20s,60℃20s,72℃20s),72℃延伸5min,4℃保温。建立限制性内切酶BsaAⅠ酶切体系,制作琼脂糖凝胶电泳观察结果。结果电泳结果表明在经过BsaAⅠ酶切后牛蒡将会产生长度分别为101bp与125bp的短条带,而毛头牛蒡未被切开仍为226bp的长条带,成功将两种药用植物区分开。该方法简单、快速、准确,满足日常对中国牛蒡属植物的鉴定。结论该实验通过从牛蒡与毛头牛蒡的ITS1序列入手,利用PCR-RFLP技术首次完成了对两种植物的鉴别研究,建立了中国牛蒡属植物的PCR-RFLP鉴别方法。

结肠小袋纤毛虫PCR-RFLP分型方法的建立

目的建立高效、特异的结肠小袋纤毛虫遗传亚型分析方法。方法选择限制性内切酶ApoI和PflMI对结肠小袋纤毛虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2的PCR扩增产物进行酶切分析,建立PCR-RFLP分型方法,利用建立的PCR-RFLP方法对猪源、羊源和豚鼠源临床粪便样品进行遗传亚型分析。结果基于ApoI和PflMI的PCR-RFLP方法可以准确区分结肠小袋纤毛虫遗传变异型A和B,用PflMI可以进一步将遗传变异型B细分为B-c和B-t两个亚型。与镜检和测序结果比较,建立的PCR-RFLP方法具有良好的特异性和更高的灵敏性,不仅可以鉴定临床样品中结肠小袋纤毛虫单个亚型,而且可以鉴别单个样品中结肠小袋纤毛虫多个亚型的混合感染。结论本研究成功建立了结肠小袋纤毛虫PCR-RFLP方法,可用于结肠小袋纤毛虫遗传多态性鉴定和分子流行病学研究。

一种基于线粒体COI PCR-RFLP单酶切快速鉴定4种巨蛎属牡蛎的方法

本文报道了一种基于线粒体细胞色素氧化酶亚基I(mt COI)基因序列PCR-RFLP单酶切的牡蛎物种鉴定方法。本方法可快速鉴定福建牡蛎(Crassostrea angulata)、熊本牡蛎(Crassostrea sikamea)、香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)和近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)等中国沿海常见的4种巨蛎属(Crassostrea)牡蛎。该方法以甲基转移酶(Msp I)作为限制性内切酶,对4种巨蛎属牡蛎的线粒体DNA COI扩增序列进行酶切,以得到的特异性条带为依据进行物种鉴定。本方法的鉴定结果与COI测序方法的鉴定结果一致,并且筛选出的单一的限制性内切酶Msp I在4种牡蛎的COI序列中不存在酶切位点的突变,准确率达到100%,能够为巨蛎属牡蛎的物种鉴别提供简便可靠的技术支撑。

用RFLP和PCR-RFLP技术研究东北虎和华南虎线粒体DNA多态性

采用ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ和ＰＣＲＲＦＬＰ技术研究了东北虎和华南虎的ｍｔＤＮＡ的多态性。在ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ研究中，分离纯化了东北虎和华南虎肝、肾和心脏组织的ｍｔＤＮＡ，用２０种识别６碱基对的限制性内切酶消化，结果只有１种限制性内切酶（ＸｂａⅠ）检测到多态性片段，其余１９种限制性内切酶消化产生的限制性格局在东北虎和华南虎完全一致。在ＰＣＲＲＦＬＰ研究中，用ＰＣＲ技术分别扩增了东北虎和华南虎ｍｔＤＮＡ的控制区（ｃｏｎｔｒｏｌｒｅｇｉｏｎ），用８种识别４碱基对的限制性内切酶分别对扩增产物进行消化，结果只有１种限制性内切酶（ＲｓａⅠ）检测到多态性片段。ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ及ＰＣＲＲＦＬＰ的结果均提示东北虎和华南虎之间的遗传距离极小。这可能与下列因素有关：两者分布区间无天然隔离屏障；具有强扩散能力；近几百年才被相互隔离。

RFLP和PCR-RFLP标记与牦牛遗传育种研究

在归纳总结RFLP和PCR-RFLP标记技术的原理、优缺点的基础上,系统论述了其在牦牛遗传育种研究中的应用现状,并提出了个人的建议和看法。

RFLP和PCR-RFLP技术与猪分子育种

RFLP作为第一代DNA遗传标记，在动植物DNA多态性研究中发挥了重要作用。RFLP和PCR技术结合而成的PCR－RFLP技术更是在DNA标记中得到了广泛应用。本文就RFLP和PCR－RFLP技术的基本原理、特点及在猪分子育种中的应用进行了综述。

拓扑异构酶II基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌

目的：探讨拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR～RFLP法鉴别常见皮肤癣菌的可行性。方法：用真菌拓扑异构酶Ⅱ基因区通用引物dPsD1、dPsD2，先后对6种34株临床常见皮肤癣菌和2株白念珠菌以及4株曲霉的DNA进行巢式PCR（nested PER）扩增，扩增后的阳性产物分别用限制性内切酶HincⅡ和HinfⅠ酶切，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，根据结果来鉴定皮肤癣菌并在种的水平上区分这6种常见皮肤癣菌。结果：通用引物dPsD1对6种皮肤癣菌均能扩增出3390bp、dPsD2能扩增出2380bp的片段，而白念珠菌和曲霉则未见阳性扩增条带。扩增出的产物分别经HincⅡ和HinfⅠ酶切后表现为58—1670bp长短不等的片段组合，根据这些特异性条带谱可以区分这6种临床常见皮肤癣菌。结论：拓扑异构酶Ⅱ基因区的巢式PCR—RFLP方法，是鉴定和区分常见皮肤癣菌的有效方法。

利用RFLP和SSR标记划分玉米自交系杂种优势群的研究

利用 RFL P和 SSR标记对 2 9个玉米自交系进行杂种优势群划分 ,筛选出 56个多态性 RFL P探针酶组合 ,6 6对多态性 SSR引物 ,分别在供试材料中检测到 187个和 2 32个等位基因变异。两种方法比较表明 ,SSR标记的平均多态性信息量 (PIC,0 .54)高于 RFLP(0 .4 2 ) ;但对供试材料的遗传多样性评价基本一致 ,平均遗传相似系数 (GS)分别为 0 .6 4和 0 .6 2。综合 RFL P和 SSR分析结果进行聚类分析 ,将供试材料划分为四平头 ,旅大红骨 ,L SC,BSSS和 PA五个类群 ,划分结果与系谱分析基本一致 ,并把系谱来源不清的种质划分到相应的杂种优势群。其中 PN群的确认 ,进一步完善了我国玉米种质杂种优势群的基本框架 ,为育种实践提供了有价值的信息。

AFLP和RFLP标记检测水稻亲本遗传多样性比较研究

利用AFLP和RFLP技术对 2 0个水稻品种 (系 )进行了遗传多样性分析。在AFLP分析中 ,用 6 4对引物组合进行了初筛 ,然后用其中适合水稻的 15对引物进行了详细研究 ,每对AFLP引物组合扩增出了 4 7～ 118条带 ,其中多态性带为 5～ 32条 ,15个引物组合共得到多态性条带 2 99条 ;在RFLP分析中 ,4 9个RFLP探针共检测出 10 7条多态性带。聚类分析表明 ,两种标记均能将 2 0个材料分成籼粳两大类群 ,但AFLP标记比RFLP标记更能反映品种间系谱亲缘和地理生态上的差异。两种标记检测出的遗传距离的趋势是一致的 ,但AFLP标记相对于RFLP而言提高了品种间的遗传距离的估计 ,降低了亚种间遗传距离的估计 ,因此 ,AFLP更适应于多样性的研究 。

中外11个猪种H-FABP基因PCR-RFLP的研究

本文利用PCR RFLP技术对五指山猪、沂蒙黑猪、汉江黑猪、莱芜猪、香猪、民猪、成华猪、内江猪、二花脸猪、巴马香猪和大白猪11个猪种共420头猪的心脏脂肪酸结合蛋白基因5′ 端上游区(HinfI RFLP)和第二内含子内(HinfI RFLP、HaeⅢ RFLP)的遗传变异进行了研究。研究表明:(1)在5′ 端上游区的HinfI RFLP位点上,所有的品种都有变异,但沂蒙黑猪和大白猪只有两种基因型(HH、Hh);(2)在第二内含子内的HinfI RFLP位点上,二花脸只有BB基因型,而其它品种都表现出多态性;(3)在第二内含子内的HaeⅢ RFLP位点上,只在五指山猪、香猪和大白猪中发现有多态性存在,等位基因D的频率分别为0 86,0 98和0 68,其余8个猪种均表现为DD型。

太湖地区典型菜地土壤微生物16S rDNA的PCR-RFLP分析

土壤微生物多样性是土壤生态功能的基础,但长期以来缺乏对高强度土地利用条件下的土壤微生物多样性的认识。作者采用间接法提取了江苏省太湖地区典型菜地土壤微生物的总DNA,以细菌的通用引物27F和1492R扩增16SrDNA片段,将扩增产物与T-载体酶连,转化大肠杆菌,建立土壤微生物16SrDNA克隆文库。PCR扩增基因文库中插入的16SrDNA外源片段,用两种限制性内切酶HhaI和RsaI分别酶切,获得该土壤173个克隆的酶切指纹图谱。结果表明,HhaI和RsaI联合酶切产生了63个基因分型,文库的覆盖度达76.30%,单一酶切产生的基因分型少,但文库的覆盖度高;克隆文库中存在两种优势类群,分别占总克隆的16%和12%。16SrDNA测序结果表明,太湖地区菜地土壤细菌在分类方面主要属于-和-变形杆菌亚门。以上结果为进一步研究太湖地区菜地土壤微生物生态功能提供了基础资料。

运用近等基因系(NIL)、AFLP、RFLP和SCAR标记对玉米S组育性恢复基因(Rf_3)的研究

以１对近等基因系（ＮＩＬ）及其回交群体（ＢＣ１）为材料，采用ＢＳＡ法，利用ＡＦＬＰ技术，筛选与Ｒｆ３基因连锁的分子标记。在筛选的１２８个ＡＦＬＰ引物组合中，有２个能在ＮＩＬ及其可育池、不育池间扩增出多态性条带ＲＲ６和ＲＲ７。１００个ＢＣ１个体验证结果表明，ＡＦＬＰ标记ＲＲ６扩增产物中仅出现２个重组体，重组率２％，由此估测ＲＲ６距Ｒｆ６基因约２．０ｃＭ。并成功地将此标记转化为 ＳＣＡＲ标记，进行了ＮＩＬ和 ＢＣ１个体的特异性扩增。在来自综 ３ × Ｐ１３８的Ｆ２：３的群体上经ＲＦＬＰ分析后，将ＲＲ６定位于第二染色体的长臂上。不仅为辅助育种奠定了基础，而且为克隆Ｒｆ３基因提供了有益的信息。

紫米基因与RFLP标记的连锁分析

选用种皮呈紫黑色的水稻体细胞无性系变异体黑珍米和其种皮呈无色的原始亲本Ｂａｓｍａｔｉ３７０配制组合，同时应用１２１个ＤＮＡ探针检测了黑珍米与Ｂａｓｍａｔｉ３７０之间的ＲＦＬＰ。应用Ｆ２和Ｆ３群体研究了紫色种皮的遗传控制。结果表明，有一个显性主效基因控制着黑珍米和Ｂａｓｍａｔｉ３７０在种皮颜色上的差异。通过多态性ＤＮＡ探针与种皮颜色的共分离分析，发现该基因与水稻第四染色体上的ＤＮＡ标记ＲＧ３２９和ＲＧ２１４连锁，与ＲＧ３２９和ＲＧ２１４的遗传图距分别为１８．９ｃＭ和２６．３ｃＭ。

猪FSHβ亚基基因RFLPs研究初报

本文用猪ＦＳＨβ基因ｃＤＮＡ作为探针，对二花脸猪、梅山猪、长白猪、大约克猪、香猪基因组ＤＮＡ进行ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ三种限制性内切酶的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析。发现猪品种之间在该位点变异较大，而且发现ＦＳＨβ／ＢａｍＨＩＲＦＬＰｓ中，太湖猪（二花脸、梅山猪）表现出品种内一致性。

花生根瘤菌遗传多样性的RFLP分析

利用16S rRNA PCR-RFLP和16S～23S rRNA IGS PCR-RFLP技术对分离自我国不同地区的55株花生慢生根瘤菌和6株参比菌株进行了遗传多样性研究。16S rRNA PCR-RFLP分析结果表明,在63%的相似性水平上,91%的供试花生慢生根瘤菌与B.japonicum和B.elkanii聚在一起;16S～23S rRNAIGS PCR-RFLP分析结果表明,供试花生慢生根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,在65.8%的相似性水平上可分为3大类群。

小麦矮秆基因Rht3的RAPD和RFLP标记分析

利用PCR和RFLP技术分析了小麦赤霉酸反应不敏感的矮秆基因Rht3的近等基因系及其分离群体。RAPD分析从 31 0条随机引物中 ,筛选出 3个引物可以在高矮亲本中稳定地扩增出多态带 ,连锁分析表明仅S1 0 60 190 0 和S1 0 60 2 0 0 0 扩增片段与Rht3连锁 ,遗传距离分别为7.1cM和 9.2cM。RFLP分析选用了主要位于第 4部分同源群短臂上的 5 3个探针 ,其中Xpsr5 84、XksuF8和Xcdo383个探针在高矮亲本中揭示出多态性 ,连锁分析表明仅Xpsr5 84与Rht3基因连锁 ,遗传距离为 8.0cM。

栽培大豆与半野生大豆杂种F_2群体中RFLP标记的偏分离及其形成原因的分析

本文研究了大豆５６个ＤＮＡ限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）标记在一栽培大豆／半野生大豆杂种Ｆ２群体中的分离。结果表明，２５％的ＲＦＬＰ标记表现了偏分离，偏离的方向主要趋于栽培大豆亲本，其形成原因主要是存在着配子体选择。这对研究大豆的遗传及育种选择等有着重要的指导意义。

猪MyoG基因的PCR-RFLP分型及其与生长性能和肌纤维数目的相关性分析

对33头申农号猪MyoG基因进行PCR-RFLP分型,结果发现3种基因型(MM,MN和NN)。M基因频率为51.5%,N基因频率为48.5%。对不同基因型猪初生重和断奶重分析发现,NN型猪初生重显著高于其他基因型猪(P<0.05),但断奶重差异不显著。根据不同基因型共屠宰12头申农号猪,取半腱肌、半膜肌和股二头肌做冰冻切片,HE染色,并计算肌纤维数目,结果表明,不同基因型猪间半腱肌和半膜肌肌纤维密度差异显著(P<0.05),其中NN型肌纤维密度高于其他基因型。

玉米RFLP连锁图谱构建及大斑病QTL定位

玉米大斑病菌存在有生理小种分化的现象。目前 5个已定名的生理小种在我国均已发现 ,还有一些尚未定名的新类群也已出现。提高玉米对大斑病的抗性 ,只有提高数量抗性才能达到目的。为了弄清楚玉米对大斑病数量抗性的基因数目及效应 ,利用抗病自交系P138和感病自交系综 3为亲本构建了F2∶3 家系群体 ,采用RFLP标记构建了包含 12 4个标记的玉米RFLP连锁图 ,覆盖玉米基因组 1999 8cM ,标记间平均距离为 16 5cM。定位了玉米大斑病的病斑长、病斑宽和病斑面积的QTL分别为 3、3、2个 ,其联合贡献率分别为 5 8 1%、71 5 %和 2 7 5 %。没有检测到病斑数 /叶的QTL ,其表现为单基因或者寡基因控制的性状。研究结果增加了对玉米大斑病的认识 ,对玉米抗大斑病育种具有重要的指导意义。

水稻抗白叶枯病基因Xa23的RFLP标记定位及其STS标记的转化

用水稻抗白叶枯病基因Xa23的近等基因系CBB23与其感病轮回亲本金刚30(JG30)杂交,构建了包含2562个单株的F2作图群体。用水稻白叶枯病广致病菌系P6进行抗性鉴定表明,F2植株抗感分离比严格符合3∶1。根据日本水稻基因组计划RGP水稻高密度图谱上的RFLP探针对F2群体中的145个感病单株进行RFLP检测和连锁分析,获得了6个与Xa23紧密连锁的RFLP分子标记。其中RFLP标记C1003A靠着丝粒一侧,与Xa23的遗传图距为0.4 cM,为Xa23的图位克隆奠定了重要基础。并将标记C1003A成功地转化为STS标记,为分子标记辅助选择育种(MAS)提供了方便有效的分子标记。