百合鳞片DNA提取及RGA-PCR体系的优化

以百合鳞片为材料,采用改良的CTAB法获得了高质量的基因组DNA。通过影响PCR反应各因子的优化,建立了适合百合的RGA-PCR反应体系:25μl体系中含30 ng模板DNA、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.6μmol/L引物及1.5 UTaq酶。扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,44℃退火1 min,72℃延伸2 min,40个循环;最后72℃延伸7 min。利用该体系对35个百合品种进行RGA-PCR,表明该反应体系具有较好的稳定性和可靠性。

均匀设计与正交设计优化海岛棉RGA-PCR体系

采用均匀设计和正交设计对影响海岛棉RGA体系Mg^(2+)、dNTP、引物以及Taq DNA聚合酶浓度等因素进行了均匀优化和正交优化试验后建立了适合于海岛棉RGA的反应体系:在10μL反应体系中1×Buffer,Mg^(2+)2.5 mmol/L,dNTP 0.25 mmol/L,引物浓度1.0μmmol/L,Taq酶0.375 U/μL,DNA 20 ng。各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以Mg^(2+)浓度影响最大,Taq DNA聚合酶的影响最小。运用该体系对海岛棉材料进行验证,证明该体系稳定可靠,并从22对RGA引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的10对引物。这一体系的建立及多态性引物的筛选为今后利用RGA标记技术进行海岛棉枯萎病研究提供了科学依据。

黄瓜RGA基因的半定量RT-PCR表达分析

以黄瓜(Cucumis sativusL.)抗霜霉病品种东农129为材料,利用RT-PCR半定量法研究了接种霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensisRostow)、喷施水杨酸(SA)和氯化钙(CaCl2)等不同处理对黄瓜抗病基因类似序列(RGA)表达的影响.结果表明:CsRGA1和CsRGA5基因的表达受霜霉病菌的侵染而启动或加强,外施SA和CaCl2都能够增强其表达;CsRGA4和CsRGA8属于组成型表达基因,其表达可能与霜霉病菌的侵染无关;CsRGA2的表达与外施SA和CaCl2缺乏密切关联.

基于PCR的水稻候选RGA标记检验和评估

在生物信息学方法开发的基于e-PCR、共显性的402个水稻候选RGA标记的基础上,随机挑选40对引物,分别以水稻品种Nipponbare和93-11的DNA为模板进行PCR扩增验证.得到清晰条带占所用标记总数的87.5%(35个标记),其中31对引物为共显性标记,4对引物为显性标记.用这31对RGA引物在24个水稻品种中进行PCR扩增,结果表明标记具有很好的通用性和特异性.RGA引物平均标记多态性指标(PIC)值为0.46,标记具有较好的多态性.

亚洲棉5号染色体RGAs克隆与分析

棉花是最主要的天然纤维作物,深入进行棉花基因组研究具有重要意义.采用酶解、前后低渗和轻压相结合的方法制备亚洲棉染色体中期膜载片,激光法分离亚洲棉第5号单染色体,建单染色体扩增池后克隆其抗病基因同源序列(RGAs),获得P7、P12、P19和P23等4个序列.序列比对和聚类分析表明,这4条序列均为NBS-LRR类RGAs,P7、P12、P19聚成一类,它们之间的同源性很高,P23聚成另一类,与黑松的RPS2和油菜的RGA30同源性较高.为该染色体分子标记开发、基因克隆乃至全序列测定奠定基础.

Isolation and Characterization of NBS-LRR Class Resistance Homologous Gene from Wheat

One resistance gene analog fragment named RGA-CIN14 was isolated from TcLr19 wheat,which contains kinase-2,kinase-3a,and the GLPL motif of the NBS-spanning region,using degenerated primers according to the nucleotide binding site （NBS） conserved domain.Based on the RGA-CIN14,a full-length cDNA,CIN14,which was 2 987 bp encoding 880 amino acids,was obtained by using the method of the rapid amplification cDNA ends （RACE）.Bioinformatics analysis showed that the deduced amino acids of CIN14 protein consisted of a NB-ARC conserved domain and many leucine-rich repeats （LRR） domains.The phylogenetic tree analysis indicated a considerable identity of the protein encoded by CIN14 with that of wheat leaf rust resistance gene Lr1,but a lower similarity with Lr21.The expression profile of the CIN14 gene detected by semi-quantitative RT-PCR showed that the CIN14 gene was not induced by Puccinia triticina and it was a constitutive gene with low abundance in the wheat leaf tissue.The resistance homology sequence was successfully obtained,which provides the shortcut for cloning of the resistance gene in TcLr19 wheat.

斑茅cDNA中抗病基因同源序列的分离和表达特性分析(英文)

植物抗病基因具有一些特定的保守结构域。本研究根据已知植物同源抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物,从甘蔗近缘植物斑茅的cDNA中扩增出6条抗病基因同源序列,它们在NCBI上登录号分别为EU685835、EU685836、EU685837、EU685838、EU685839和EU685840。序列分析表明,这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因保守结构域P-loop、kinase-2a、kinase-3a和疏水结构域(hydrophobicdomain,HD)。氨基酸序列的同源性比对表明,6条RGAs序列同11条参试的抗病基因之间的同源性为8.3%～93.0%,而6条RGAs之间的氨基酸序列同源为30.5%～45.6%。另外,本实验所克隆的6条斑茅抗病基因同源序列中,kinase-2(LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸,推测所克隆的NBS-LRR类抗病基因都属于non-TIR-NBS-LRR类。定量PCR分析表明,6条斑茅抗病基因同源序列在根、茎和叶片中组成型表达,同时这些抗病基因同源序列的表达会受外源信号分子水杨酸和过氧化氢的上调作用,可能在斑茅的抗病性中具有一定的作用。

马铃薯kunitz型蛋白酶抑制子基因片段的分离及表达分析

以马铃薯高抗青枯病基因型ED13为材料,利用cDNA-RGA方法获得了青枯病菌处理和水对照处理之间的差异表达片段(KTI-likeEST)。该EST与kunitz-type抑制子基因高度同源,属于kunitz-type抑制子基因家族,是马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制子基因家族的重要成员。半定量RT-PCR分析表明该基因受青枯病菌的诱导,12h内启动表达,48h内表达量达最高。马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制子基因参与马铃薯对病原的抗病防御,推测所获得的KTI-likeEST也可能参与了马铃薯的抗病防御。

柑橘黄龙病侵染相关抗病基因同源序列的克隆鉴定与表达分析

[目的]从黄龙病耐病寄主植物cDNA中筛选抗病基因相关序列并对其进行表达分析研究。[方法]根据已克隆的植物抗性基因表达产物NBS-LRR保守区域设计简并引物,以耐HLB的柑橘属柚cDNA为模板扩增RGAs,并进行实时荧光定量PCR。[结果]通过RFLP分析及克隆测序共得到5个NBS类抗病基因相似序列(RGAs)片段,在GenBank上登录号为HM777043～HM777047。通过Clustalx、DNAMAN等软件分析5个RGAs及其推导的氨基酸的相似性,结果显示它们均含有典型NBS-LRR类抗性基因所具有的保守区域:P-loop、Kinase-2a、GL-PLAL,其与已克隆的烟草N、亚麻L6、拟南芥RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等抗病基因在保守区域氨基酸水平上的相似性为19.71%～42.86%。根据得到的序列设计特异性引物,对5个RGAs在HLB侵染过程中的表达进行定量PCR,结果显示嫁接病芽接穗后的8次连续采样中5个RGA的表达受到不同程度的调控。[结论]表明5个RGAs可能与黄龙病的侵染有关。

利用中间偃麦草抗病基因同源序列分离黄矮病抗性候选基因克隆

根据已克隆植物抗病 (R)基因编码蛋白质的保守结构设计简并引物 ,利用同源序列法PCR扩增、克隆到 9个具有开放阅读框的中间偃麦草R基因同源片段 (ResistanceGeneAnalogs ,RGAs)。利用抗黄矮病材料 (含Bdv2 )、感黄矮病材料 (无Bdv2 )进行RFLP分析 ,筛选到 1个NBS类RGA序列TirgaZ1与Bdv2连锁。根据TirgaZ1的序列重新设计 1对引物 ,优化PCR扩增条件 ,将其转化为经典特异PCR标记 (SC TZ1)。利用该特异PCR标记 (SC TZ1)和克隆池 PCR法筛选抗黄矮病小麦 中间偃草易位系HW6 4 2基因组的可转化人工染色体 (Transformation competentArtificialChromosome ,TAC)文库 ,分离到 4个阳性TAC克隆T1～T4。限制酶切图谱分析结果表明 ,T1～T3为 1类 ,插入片段约 2 3kb ,T4为另 1类 ,插入片段约为 2 5kb。以TirgaZ1为探针 ,通过Southern杂交证实了阳性TAC克隆T1、T4为含有TirgaZ1序列的抗病基因候选克隆。分别以中间偃麦草、HW6 4 2和小麦亲本为探针对阳性克隆T1、T4进行Southern分析 ,结果表明 ,阳性TAC克隆T1、T4的插入片段均具有抗黄矮病易位系的中间偃麦草易位染色体片段 7XL ,T1、T4为抗黄矮病基因候选克隆。测定和分析阳性克隆T1插入片段 5 '端 - 6 4 4 8bp部分的序列 ,表明其最长完整开放阅读框

小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与特征分析

根据已克隆植物抗病(R)基因NBS保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),在小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中进行抗病同源基因cDNA全长的扩增。获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S11A11cDNA序列,该序列全长2923bp,编码878个氨基酸序列。生物信息学分析结果表明,该片段含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域。聚类分析表明,S11A11编码的蛋白与小麦抗叶锈病基因Lr1编码的蛋白亲缘关系较近,而与Lr10亲缘关系较远。半定量RT-PCR分析表明,该基因在小麦叶片中为低丰度组成型表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病基因同源序列,为最终克隆小麦抗叶锈病目的基因奠定了基础。

TcLr35小麦中抗病基因同源序列的克隆及分析

根据已克隆的植物抗病基因保守结构域设计简并引物,采用同源序列法(RGA)和电子克隆技术在叶锈菌诱导的TcLr35小麦cDNA中获到了1个NBS-LRR类抗病同源基因,暂命名为TcLr35-S11A11。该基因长1 419bp,ORF区为1 323bp,编码440个氨基酸,含有典型的NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域;系统发育分析表明其编码蛋白与大麦、燕麦的NBS-LRR类抗性蛋白聚为一类;半定量RT-PCR分析表明,该基因在小麦叶片中为低丰度组成型表达,为进一步克隆该基因及研究叶锈菌与TcLr35小麦互作体系中抗病机理奠定了基础。