基于PCR的水稻候选RGA标记检验和评估

在生物信息学方法开发的基于e-PCR、共显性的402个水稻候选RGA标记的基础上,随机挑选40对引物,分别以水稻品种Nipponbare和93-11的DNA为模板进行PCR扩增验证.得到清晰条带占所用标记总数的87.5%(35个标记),其中31对引物为共显性标记,4对引物为显性标记.用这31对RGA引物在24个水稻品种中进行PCR扩增,结果表明标记具有很好的通用性和特异性.RGA引物平均标记多态性指标(PIC)值为0.46,标记具有较好的多态性.

小麦抗白粉病基因Pm4b的RGA分析

为克隆抗性基因和发展Pm4b的特异分子标记奠定基础。利用10对RGA引物,对小麦抗白粉病基因的一些载体品种(系)进行扩增,将引物对R11F/R11R从Pm4b基因的载体品种VPM中扩增出的稳定多态性条带回收、克隆、测序,获得与小麦Pm4b基因的相关抗病基因的同源片段,并对不同的小麦Pm基因载体品系作了检测分析。该稳定多态性条带全长1 321 bp。序列分析表明这个片段属于RGA类序列。用该标记检测小麦不同Pm基因载体品种(系),发现该多态性片段仅出现在Pm4b基因载体品种中。该研究可为分离抗性基因和发展Pm4b的特异分子标记奠定基础。

与多花黑麦草抗灰叶斑病相关基因紧密连锁的RGA-CAPS标记筛选

以多花黑麦草抗灰叶斑病品种Sach iaoba、感病品种M inam iaoba及其杂种F1分离群体为材料,采用接种鉴定和分群分析法(BSA)进行抗病基因类似物限制性内切酶酶切多态性(RGA-CAPS)筛选。得到与多花黑麦草抗灰叶斑病相关基因紧密连锁的RGA-CAPS标记,该标记与灰叶斑病抗性相关基因紧密连锁,连锁距离为4.94cM。测序和BLASTX查询结果显示,该RGA与水稻的1个NBS-LRR类抗性蛋白(Genbank/NCB I:AAT81729.1)同源性高达67%,序列分析结果显示,对应于抗、感病性的该RGA片段长度均为361 bp,两片段之间存在多个单核苷酸差异(SNPs)。利用SNPs重新设计引物,并应用新设计引物成功地将RGA-CAPS标记转换成共显性STS标记。

植物抗病基因同源序列(RGA)研究进展

目前已克隆了48个植物抗病(R)基因,其表达产物在不同的物种具有典型的保守结构区域,按其序列的同源性可以将其归为NBS-LRR、eLRR、LRR-STK等几个超家族。根据这些保守序列设计合适的引物进行PCR扩增,即得到抗病基因同源序列(RGA)。对RGA与R基因关系的分析表明,RGA不仅在抗病基因定位和抗病基因系统进化研究中有重要作用,而且有可能为克隆R基因提供一条崭新而又便捷的途径。

花生DNA分子标记的研究 ⅡRGA标记

采用4对RGA引物、9份花生材料进行PCR扩增,只有引物NLRR inv1/inv2扩增出产物.采用该对引物扩增,18份材料中只有10份获得产物.总共获得58条迁移率不同的带,其中多态性带56条.根据条带共享程度计算出的带型相似指数为0.188～0.986.10份材料可以按条带数目多寡分成两大类.

辣椒疫病抗性相关的共显性RGA-STS标记的开发及应用

采用辣椒抗病基因同源序列(Resistance gene analogues)(RGA2)设计1对特异引物,对高抗辣椒疫病品种CM334和极感疫病品种Early Calwonder(EC)进行多态性扩增,开发出共显性的RGA-STS1200标记。利用STS1200标记在具有不同疫霉菌生理小种抗性的辣椒材料CM334、PBC459、PBC137-1和对辣椒疫霉菌3个生理小种都不具抗性的辣椒材料EC、茄门和B2间进行多态性扩增。结果表明,由3个辣椒疫病抗性材料所扩增出的条带大小一致,而由3个感辣椒疫病品种所扩增出的条带大小一致。说明STS1200标记可用于鉴定辣椒疫病抗、感材料。同时,利用共显性的RGA-STS1200标记在苗期及时剔除CM334和EC正反杂交所得F1代假杂种,进一步构建用于辣椒疫病抗性研究用的F2代分离群体。这是少数报道利用RGA-STS标记对辣椒疫病抗性进行鉴定,也是第一次利用RGA-STS标记对作物种子真伪进行鉴定。

花生RGA-SSCP实验条件的优化

单链构象多态性(SSCP)技术是一种简便、灵敏的多态性检测方法,近年在植物研究中得到了较多应用。为了检测花生品种间抗病基因同源序列(RGA)的单核苷酸差异,对影响花生RGA-SSCP的电泳温度、电压、胶浓度、交联度、变性剂等因素进行了优化。结果表明,碱变性后的PCR产物(PCR产物与碱变性剂比例1∶2)在不加甘油的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为29∶1)、1×TBE电泳缓冲液、恒温4℃和600V条件下电泳5 h为最佳优化组合。用上述优化方法分析了抗、感北方根结线虫病的亲本及F2群体部分单株,获得了电泳条带细而清晰的SSCP图。该体系的建立对RGA-SSCP标记用于花生基因定位、遗传图谱构建、标记辅助选择等具有重要意义。

RGA标记的开发及与棉花黄萎病紧密连锁分子标记的研究

通过对GenBank数据库上公布的棉花抗病基因序列及NCBI核苷酸序列数据库查找分析得到28个与抗病性相关的基因,共包含392条cDNA序列,利用软件Primer Premier 3.0,最终设计出107对RGA引物,利用设计出的RGA引物,对以3组杂交棉花亲本及F2群体的基因组DNA为模板进行扩增,筛选出11对稳定多态性且与棉花抗黄萎病基因紧密连锁的标记。其中,Gbrga70与抗性基因的交换值和遗传距离最大,分别为22.60%和24.40cM。Gbrga55与抗性基因的交换值和遗传距离最小,分别为7.19%和7.24cM。对抗黄萎病和感黄萎病品种单株进行χ2检测证明,该基因的抗性可能受多基因控制或微效基因控制。查找连锁标记来源发现根据拟南芥RPP5基因设计的引物最多,共有4对(占36.4%)。结果表明,基于抗病基因序列开发棉花RGA标记是可行的。

辣椒抗疫病相关基因的RGA-STS标记的开发

利用西北农林科技大学园艺学院辣椒课题组克隆的辣椒抗疫病相关的全长基因RGA1(GenBank登录号:GQ386945)设计一对引物,上游引物为BY32,下游引物为RBQC-R。以对辣椒疫病高抗的品种CM334和感病品种EC为试材,利用PCR技术分析辣椒抗疫病的Sequence Tagged Sites(STS)标记。结果表明,在高抗品种CM334中得到700 bp大小的STS700标记,而在感病品种EC中未扩增出相应大小的片段。在多个不同抗疫病辣椒品种中验证说明,STS700标记鉴定辣椒疫病抗性可靠、稳定。

马铃薯抗晚疫病主效基因R10的RGA-CAPS标记的开发

马铃薯晚疫病抗性基因R10,属于马铃薯抗晚疫病主效位点MLB单倍型之一,该位点已知的各单倍型基因均具有保守结构域,属于同一个R3a基因家族。将R3a基因和源于MLB位点的R3a基因的同源序列进行比对,根据它们高度保守的区域设计引物,以马铃薯晚疫病鉴别寄主MaR10(含抗晚疫病基因R10)、四倍体马铃薯栽培种Katahdin(不含已知抗病基因)及其杂交一代为试材,得到R3a的抗病基因同源序列,再结合限制性内切酶筛选,开发出与马铃薯抗晚疫病主效基因R10连锁的两个RGA-CAPS标记:RGA-600和RGA-1000,这两个标记距离R10基因0.25cM。

DNA分子标记的研究进展及几种新型分子标记技术

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种比较理想的遗传标记技术。综述了DNA分子标记的类型,基本原理和特点,同时还对几种最新出现的分子标记技术作了简要的介绍。

花生作图亲本间分子标记的多态性分析

利用Ah MITE、SSR、SRAP及SRAP-RGA 4种分子标记技术研究了花生(Arachis hypogaea Linn)作图亲本花育22号与"950527"间的分子多态性。经过初筛和复筛,822对Ah MITE引物、1 106对SSR引物、460对SRAP和731对SRAP-RGA引物在两亲本间表现稳定多态性的数量分别为101、207、25和72对,多态性比率分别为12.3%、18.7%,5.4%和9.8%。结果表明,SSR标记揭示作图亲本间多态性的效率最高,其次是Ah MITE标记,SRAP标记的多态性和重复性最差。

簇毛麦6V染色体短臂特异分子标记的开发和应用

为开发簇毛麦6V染色体短臂特异的分子标记,并利用这些标记对缺失系进行鉴定,选用11个RGA和17对STS引物进行多态性分析,其中1个RGA引物和1对STS引物在对普通小麦扬麦5号、簇毛麦及普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系进行多态性分析时,分别检测到一条约1000bp和约800bp的多态性片段,将这两个标记转化为稳定的特异性分子标记,分别命名为CINAU17-1086和CINAU18-723。运用这两对引物对一系列材料进行扩增,只有含6V染色体短臂的材料才能扩增出相应的特异条带,表明这两个标记均位于簇毛麦6VS上。进一步利用簇毛麦6VS缺失添加系、易位系将CINAU17-1086标记定位在簇毛麦6VSFL0.58与FL0.70之间,将CINAU18-723标记定位在簇毛麦6VSFL0.45与着丝粒之间。利用这两个特异标记对通过花粉辐射获得的部分簇毛麦6VS结构变异材料进行PCR鉴定,其结果与细胞学鉴定结果一致。CINAU17-1086和CINAU18-723标记可用来快速检测和追踪导入普通小麦背景中的簇毛麦6VS染色体片段,并对缺失系的断点进行了初步界定。

玉米抗南方型锈病基因共分离分子标记的研究

本文以玉米(Zea maysL.)抗南方型锈病自交系P25和感病自交系F349的F1与F349回交,并连续回交所得BC5代的F349抗病近等基因系(nearly isogenic lines,NILs)为材料,以RGA(resistance gene analogs)的方法,在抗病自交系中克隆出一条321 bp的特异性DNA条带。根据序列比对的结果,设计出新的引物作为分子标记,在96株BC7、BC4F5NILs及其亲本和杂种F1群体上进行鉴定,其中94株的田间抗感结果与分子检测结果一致,选择的有效率达97.9%。此标记扩增效果清晰、可重复性强,在抗玉米南方型锈病的分子标记辅助育种研究中有应用价值。