七鳃鳗口腔腺重组蛋白rLj-RGD3对人肝癌HepG2细胞活性的影响

七鳃鳗口腔腺含有RGD功能基因,为了确认其表达蛋白在抑制肿瘤方面的功能,在前期获得带有组氨酸标签的分子量为14.5kD的基因重组蛋白rLj-RGD3基础上,研究了不同浓度rLj-RGD3对HepG2细胞的增殖、凋亡、黏附、迁移、侵润的影响.结果显示:rLj-RGD3能显著抑制HepG2细胞的增殖,IC50为3.8μmol/L,诱导HepG2细胞发生凋亡,有效抑制HepG2细胞黏附玻蛋白(VN),抑制HepG2细胞的迁移,且抑制率达58%,明显抑制以bFGF为趋化剂的HepG2细胞穿透Matrigel的侵润行为.以上研究表明,rLj-RGD3具有典型的RGD毒素蛋白抑制肿瘤细胞的功能,能够应用于抗肿瘤基因工程药物开发,具有重要的应用意义.

家蚕核型多角体病毒广东分离株Bm126基因编码基序RGD的功能研究

杆状病毒因专一感染昆虫而作为治理农林害虫的生物农药以及作为表达载体在生物医药产业得到广泛应用。前期研究发现家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)中国广东分离株(Bm NPV-GD)的orf126基因(Bm126)包含一个编码精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的基序。采用点突变技术构建RGD编码基序突变的转移载体,利用Bm NPV Bac-to-Bac系统转座获得重组bacmid,通过转染Bm N细胞获得重组病毒,分析突变病毒在感染细胞后期的多角体产量变化,并在病毒感染过程中进一步应用RGD竞争性多肽Cyclo[RGDf-N(Me)V-]分析突变病毒多角体产量的变化,以此探究Bm NPV Bm126编码的RGD基序是否在病毒感染增殖中发挥作用。经t检验统计表明突变病毒感染Bm N细胞后产生的多角体数量与对照病毒没有显著性差异,Cyclo[RGDf-N(Me)V-]处理结果也显示其与对照没有显著差异,表明Bm NPV-GD Bm126基因编码的RGD基序可能不是直接参与病毒感染宿主细胞后的增殖过程,而是辅助病毒的其他因子与宿主细胞互作。

RGD修饰的内皮抑素30肽对胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移作用的实验研究

目的研究经RGD修饰的人内皮抑素(endostatin)N-端的30肽对胃癌SGC-7901细胞增殖及转移能力的影响。方法人工合成人内皮抑素1～30位氨基酸(30肽,25～31序列由RGIRGAD改为RGDRGD)所对应的核苷酸序列,连接到质粒pTYB2中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,同法合成人内皮抑素1～27位氨基酸构成的27肽作为对照。用WST-1试剂检测SGC-7901细胞的增殖情况;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;明胶酶谱实验观察30肽和27肽对基质金属蛋白酶MMP2和MMP9活性的影响。结果与27肽相比,30肽能够有效抑制SGC-7901细胞的增殖、侵袭和迁移,同时抑制了MMP2和MMP9的活性。结论 30肽可能是通过下调MMP2和MMP9的活性而抑制SGC-7901细胞的转移,其在临床胃癌的治疗上具有潜在的应用前景。

基于表面等离子体共振(SPR)技术实时分析RGD基序与整联蛋白的相互作用

旨在研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1上的RGD(Arg-Gly-Asp)基序与宿主细胞表面受体整联蛋白的结合特异性,作者应用基于表面等离子共振技术(SPR)的Biacore 3000系统实时研究RGD基序分别与猪源整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域、α_v亚基胞外区结构域和β_6亚基胞外区结构域的亲和力。首先通过结合试验筛选与RGD基序有结合的整联蛋白结构域,再对有结合的整联蛋白与RGD基序开展动力学分析。结果显示,合成的RGD基序与猪源整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为42.3 M~(-1)s~(-1)、3.1×10~(-4)s~(-1)和7.33×10~(-6)M;与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间亦有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为21.8 M~(-1)s~(-1)、2.13×10~(-4)s~(-1)和9.79×10~(-5)M;与β_6亚基胞外区结构域几乎没有结合。综上表明,RGD与整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域的结合比与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间的结合快且亲和力强。本研究将为进一步探讨FMDV与宿主细胞表面受体的相互作用提供参考。

RGD靶向溶栓药物的研究进展

溶栓药物的靶向运输系统可提高溶栓药物的特异性和靶向性,减少溶栓药物全身用药所致的各种不良反应和临床并发症。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的活化是血小板聚集的最终共同通道,在血栓形成中起到重要作用。RGD序列作为活化血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的特异性配体,具有抗血小板聚集作用和血栓靶向性。因此国内外学者运用RGD序列制备靶向溶栓药物,并对此类药物进行靶向溶栓研究。现就RGD靶向溶栓药物的研究进展做一综述。

RGD模体在肿瘤诊断与靶向治疗方面的研究现状

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginyl-glycyl-aspartic acid,RGD)模体是一类含有RGD序列的短肽,有环形和线性两类,可以竞争性结合整合素受体,阻止肿瘤细胞与细胞外基质的黏附,还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡,通过阻断整合素-斑点黏附激酶途径,抑制肿瘤细胞黏附、增殖、侵袭、转移。该类肽与整合素结合成为抗肿瘤药物设计的靶点。随着对其分子机制的深入研究,越来越多的含RGD模体的药物被运用于肿瘤的早期诊断和临床抗肿瘤的治疗。

含RGD模体的人白细胞介素18(IL-18)突变体的酵母表达及其抗血小板聚集活性

利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL18)cDNA序列中插入GGC序列,使IL18第39位精氨酸残基和第40位天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD模体.此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichiapastoris酵母GS115,利用表达系统进行了高效表达.用SephadexG100凝胶过滤纯化表达产物,获得初步纯化的蛋白.对该蛋白进行了血小板聚集抑制实验和对GPⅡbⅢa与Fn结合的抑制实验.含RGD模体的重组IL18(IL18RGD)显示了较强的体外抑制血小板聚集活性,IC50=8.8μmolL;并具有与GPⅡbⅢa的竞争结合活性,IC50=8.0μmolL.该含有RGD模体的重组IL18仍保存对PBMC诱导产生IFNγ能力.结果表明,此IL18RGD嵌合体在具有抗炎,抗感染的同时增添了新的抑制血小板聚集功能.

人白介素18(IL-18)RGD模体抗黑色素瘤细胞B16活性研究

利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL-18)的cDNA序列中插入了GGC序列,使IL-18第39精氨酸残基和第40天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD模体。此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichia Pastoris酵母GS115,利用表达系统进行了高效表达。用Sephadex G-100凝胶过滤纯化表达产物,获得初步纯化的蛋白。研究表明,IL-18在体外对黑色素瘤细胞株B16没有作用,而IL-18-RGD抑制作用明显,IC50=8·10μmol/L;应用小鼠动物模型研究结果显示,IL-18及IL-18-RGD均对黑色素瘤细胞B16有抑制作用,且IL-18-RGD比IL-18的作用强;同时,对鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoicmembrane,CAM)血管生成的抑制实验发现,IL-18-RGD对CAM血管生成的抑制作用也比IL-18强。但IL-18-RGD仍保存对PBMC诱导产生IFN-γ能力。结果提示,IL-18-RGD在具有抗炎,抗感染作用的同时增添了抑制肿瘤血管新的功能。

R^(49)A^(50)RGDN^(54)P^(55)突变成I^(49)P^(50)RGDM^(54)P^(55)对华丽蛇毒素活性的影响(英文)

用基因点突变技术将已知具有强抑制血小板凝集作用的去整合蛋白———kistrin的RGD袢区IPRGDMP替换抑制血小板凝集作用较弱的elegantinRGD袢相应部位的RARGDNP,重构一个新的杂合的去整合蛋白,然后,分析该杂合蛋白对血小板凝集的抑制作用。结果表明,重组的杂合去整合蛋白比野生型elegantin具有更强的抑制血小板凝集活性。推测RGD顺序两翼的氨基酸残基在保持去整合蛋白的结构和功能中起重要作用。

内皮抑素30肽对SGC-7901细胞增殖及转移能力的影响

目的研究经RGD修饰的人内皮抑素(endostatin)N-端的30肽对胃癌SGC-7901细胞增殖及转移能力的影响。方法人工合成人内皮抑素1～30位氨基酸(30肽,序列25～31由RGIRGAD改为RGDRGD)所对应的核苷酸序列,连接到质粒pTYB2中,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。用WST-1试剂检测30肽对SGC-7901细胞增殖的影响;细胞划痕实验和迁移实验观察30肽对细胞运动迁移的影响;明胶酶谱实验观察其对肿瘤转移相关基因MMP-2、MMP-9表达和分泌的影响。结果30肽能够有效抑制SGC-7901细胞的增殖、侵袭和迁移,同时还抑制了MMP-2和MMP-9的活性。结论 30肽可能是通过下调MMP-2和MMP-9的活性而抑制SGC-7901细胞的转移,其在胃癌的临床治疗上具有潜在的应用前景。

内皮抑素30肽对SGC-7901细胞增殖活性的影响

目的研究经RGD修饰的人内皮抑素(endostatin)N-端的30肽对胃癌SGC-7901细胞增殖能力的影响。方法人工合成人内皮抑素1～30位氨基酸(30肽,25～31序列由RGIR GAD改为RGDRGD)所对应的核苷酸序列,连接到质粒pTYB2中,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,用WST-1试剂检测30肽对SGC-7901细胞增殖活性的影响。结果 30肽能够有效抑制SGC-7901细胞的增殖,并呈时间剂量依赖性。结论 30肽能有效抑制SGC-7901细胞的增殖,其在临床胃癌的治疗上具有潜在的应用前景。

人白介素18(IL-18)插入突变体抗血管新生作用的研究

目的构建IL-18的定点突变体,并研究其对血管新生的抑制作用。方法利用基因重叠延伸剪接技术,在人白细胞介素18(IL-18)的cDNA序列中插入一个GGC序列,使IL-18第39位精氨酸和第40位天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD模体。将此cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并在酵母PichiaPastorisGS115中得到高效表达。结果IL-18-RGD仍保存对PBMC诱导产生IFN-γ能力外,对ECV304细胞的增殖(IC50=7.80μmol/L)和对ECV304向Fn的黏附均具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖关系;而野生型IL-18对ECV304细胞向Fn的黏附则没有作用。结论与野生型IL-18相比,IL-18-RGD增加了抗血管生成作用,从而增强其抗肿瘤能力。

幽门螺杆菌CagL变异体功能研究

目的：CagL作为幽门螺杆菌Cag- T4SS的一个基本组成部分，其通过RGD模体在胃上皮细胞内与整合素α5β1受体结合参与CagA的转运，本研究旨在探讨幽门螺杆菌CagL变异体的功能。方法：在这项研究中,通过组织学分析、体内外IL-8分泌检测、粘附实验和CagA转运实验被采用，发现一种新型的Ass57和Ass58缺失的CagL变异体，该变异体与野生型CagL的功能差别被研究。结果：野生型CagL幽门螺杆菌携带患者，其胃粘膜炎症细胞浸润程度高于CagL变异体携带者（3.20±0.80，1.63±0.32，=0.03）。野生型CagL幽门螺杆菌携带者，其胃粘膜IL-8水平高于CagL变异体携带者（141.57±29.77 pg/mg和104.96±21.50 pg/mg，〈0.01）。野生型CagL组GES-1细胞IL-8分泌含量高于CagL突变组（1544.87±112.61 pg/ml和1277.36±89.19 pg/ml，〈0.01）。CagL突变组的粘附活性低于CagL野生组[（11.38±1.04）×10^6和（16.70±1.47）×10^6，〈0.01）]，CagA的转运实验也出现了相似的结果。结论：我们发现新的CagL变异体可能是通过改变CagL三维结构的稳定性以减弱幽门螺杆菌的致病性。

重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-RGD3表达及对Hela细胞活性的影响

为研究重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-RGD3的抗肿瘤活性,确定其生物学地位及意义,本研究提取成体七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺组织总RNA,经RT-PCR获得cDNA序列长度为357bp的目的基因片段,将其克隆于pET23b载体,获得带有组氨酸标签的分子量为15kD的基因重组蛋白rLj-RGD3的高效可溶性表达,通过组氨酸亲和层析纯化蛋白。采用MTT法检测不同浓度rLj-RGD3对bFGF诱导下的Hela细胞增殖的抑制作用,结果表明rLj-RGD3能显著抑制Hela细胞的增殖,IC50为2.6μmol/L。rLj-RGD3作用后的Hela细胞经Hoechst染色及DNAladder检测结果显示,细胞均发生凋亡。rLj-RGD3对Hela细胞黏附玻连蛋白(VN)作用的实验结果为有效抑制。采用Transwell细胞培养板对bFGF诱导下的Hela细胞迁移实验表明,rLj-RGD3能够抑制Hela细胞的迁移,且抑制率达60%。采用人工基质膜基质Matrigel及Transwell模仿体内环境研究rLj-RGD3对Hela细胞浸润行为实验显示,以bFGF为趋化剂的Hela细胞穿透Matrigel的浸润行为明显受到抑制。以上研究表明,rLj-RGD3具有典型的RGD毒素蛋白的功能,有望应用于抗肿瘤基因工程药物开发,具有重要的生物学意义。

表面展示RGD模体重组噬菌体的构建和鉴定

将RGD多肽编码序列克隆至辅助噬菌体M13KO7 PⅢ基因中,获得重组载体M13KO7-RGD,包装噬菌粒pAAV-GFP后获得重组噬菌体颗粒,通过透射电子显微镜观察形态,Western-blot鉴定PⅢ-RGD融合序列的表达。将其转导不同哺乳动物细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达。结果表明:成功获得展示RGD模体的重组噬菌体颗粒,且具有典型丝状噬菌体形态特征,转导不同细胞系后有绿色荧光蛋白表达,提示该重组噬菌体能够导入哺乳动物细胞,为动物基因工程疫苗载体的研发提供新的思路。

RGD基序邻近氨基酸突变对口蹄疫病毒O/JC/2010株毒力的影响

为了研究RGD基序邻近氨基酸位点对口蹄疫病毒毒力的影响,利用O/JC/2010株病毒的基因组全长cDNA分子克隆,置换O/HN/93株病毒的VP1基因,拯救获得了1株嵌合病毒(pBlue-HJ);除此之外,在O/JC/2010VP1的3个氨基酸位点进行突变P142T、A152D、Q153P,分为4组,拯救出4株突变病毒:pBlue-HJ(142)、pBlue-HJ(142+152)、pBlue-HJ(152+153)、pBlue-HJ(142+152+153)。比较这5株病毒的LD50和TCID50特性,发现P142T、A152D可以增强口蹄疫病毒对BHK-21细胞和乳鼠的致病力,而Q153P则相反。该试验证明RGD基序附近的非保守氨基酸位点对口蹄疫病毒的毒力存在影响,为进一步阐明口蹄疫病毒的分子致病机制奠定了基础。