大鼠RGS4基因的克隆及在原核中的表达

目的构建pGEX4T-1-RGS4载体,并检测融合蛋白GST-RSG4在原核中的表达水平。方法采用RT-PCR方法,将克隆SD大鼠G蛋白信号转导调节因子(regulator of G protein signaling4,RGS4)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pGEX4T-1中,IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白GST-RSG4的表达水平。结果成功构建了pGEX4T-1-RGS4载体;经IPTG的诱导,RGS4可与GST以融合蛋白的形式高效表达。pGEX4T-1-RGS4在原核内表达产物相对分子质量约为50×103,与预期融合蛋白大小一致。结论构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达。

急性肺损伤后RGS4的表达变化及地塞米松对其的影响

目的:研究急性肺损伤后RGS4的表达变化及地塞米松对其的影响,以探讨RGS4在急性肺损伤发病机制中的作用。方法:采用油酸性急性肺损伤模型,以肺含水率为肺水肿的指标,采用Western blot和免疫组织化学方法检测急性肺损伤后RGS4的表达变化。结果:油酸性急性肺损伤后6 h肺含水率即显著升高,24 h达到高峰,48 h较24 h有所降低但仍高于生理盐水组;RGS4蛋白含量在伤后6、24、48 h均显著升高,与肺含水率的变化趋势一致。地塞米松处理后可显著降低各时点的肺含水率和RGS4蛋白含量。结论:RGS4参与了油酸性急性肺损伤的发病机制,糖皮质激素治疗可降低急性肺损伤后的RGS4蛋白含量。

人rgs4真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建人rgs4基因真核表达质粒。方法采用RT-PCR方法,扩增人rgs4基因片段。插入真核表达质粒pc DNA3.1中,转化大肠杆菌DH5α,通过琼脂糖电泳、双酶切挑选和测序验证阳性重组克隆。结果RT-PCR自人胚肾上皮细胞(HEK293)中扩增出目的基因片段,插入目的基因的真核表达载体的酶切谱与设计一致,测序结果证明为人rgs4基因。结论成功构建了人rgs4编码框全长的真核细胞表达质粒。

CXCR4、RGS4及RAGE在小儿肾母细胞瘤中的表达及临床意义

目的分析选择趋化因子受体(CXCR4)、蛋白信号调节因子4(RGS4)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)在小儿肾母细胞瘤中的表达及临床意义。方法选取2015年6月至2020年6月本院收治的98例小儿肾母细胞瘤患者,手术留取肾母细胞瘤组织纳入研究组,并选取距离肿瘤边缘>5 cm的正常肾组织纳入对照组(经病理筛查无癌细胞后最终纳入73例)。比较两组CXCR4、RGS4及RAGE表达水平,分析影响肾母细胞瘤患者预后死亡的独立危险因素。结果对照组CXCR4、RAGE高表达率低于研究组,RGS4高表达率高于研究组,差异均有统计学意义(P<0.05)。临床分期Ⅲ~Ⅳ期、预后不良组织结构(UH)、有淋巴结转移者CXCR4、RAGE高表达率高于临床分期Ⅰ~Ⅱ期、预后良好组织结构(FH)及无淋巴结转移者,差异均有统计学意义(P<0.05)。FH者RGS4高表达率高于UH者,差异有统计学意义(P<0.05)。临床分期Ⅲ~Ⅳ期、预后不良组织结构、有淋巴结转移、CXCR4、RAGE高表达及RGS4低表达是影响肾母细胞瘤患者预后死亡的危险因素(P<0.05)。结论 CXCR4、RGS4及RAGE在小儿肾母细胞瘤组织中表达异常,并与肾母细胞瘤发生、发展有关,临床上可通过检测三者表达情况对患者病情进展及预后进行评估。

RGS4在HUEVCs凋亡中的作用及地塞米松对其的影响

目的研究RGS4对常氧和低氧培养条件下HUEVC细胞凋亡的影响及地塞米松在其中的作用,以探讨RGS4在HUEVC细胞凋亡中的作用及地塞米松处理对其的影响。方法采用O2/N2/CO2三气培养箱模拟常氧和低氧条件培养HUEVC细胞,RGS4真核表达载体转染HUEVC细胞后采用流式细胞仪(Annexin-V-FITC-PI法)检测细胞凋亡。结果常氧条件下RGS4转染细胞和地塞米松处理对细胞凋亡无明显影响,低氧培养条件下细胞凋亡增加(P<0.01),RGS4转染后可使HUEVC细胞凋亡显著减少(P<0.01),地塞米松和RGS4同时处理后HUEVC细胞的凋亡与单纯RGS4转染无显著差别。结论RGS4不影响常氧条件下的HUEVC细胞凋亡,但可明显抑制低氧条件下的HUEVC细胞凋亡,地塞米松抑制细胞凋亡的作用可能与RGS4有关或者通过相同的细胞信号通路抑制低氧条件下的细胞凋亡。

RGS4对阿片受体信号转导途径中腺苷酸环化酶活性的影响

目的 探讨 RGS4在整体细胞中对阿片受体信号转导途径中腺苷酸环化酶 (AC)活性的影响。方法 采用共转染法将μ-受体、δ-受体和 RGS4基因导入 HEK- 293细胞，受体结合法确定转染效率。用不同浓度的吗啡、 DAMGO和 DPDPE分别激活μ-受体和δ-受体，放射性蛋白竞争结合（非标记底物）法测定 cAMP浓度 。结果 受体被其特异的激动剂激活后，单独转染 μ-受体或δ-受体基因的细胞其 AC活性被抑制，且对激动剂表现出高度的剂量依赖性；空质粒（ pcDNA3）转染的细胞之 AC活性不受各种激动剂影响 ;同时转染 RGS4和 μ-受体基因的细胞其 AC活性虽然也呈现剂量依赖性抑制，但抑制的强度比单独转染μ-受体基因的细胞明显减弱 ; RGS4和 δ-受体基因共转染并不影响δ-受体对 AC活性的抑制。受体结合实验显示 RGS4不影响μ-受体和δ-受体的表达。结论 RGS4能逆转μ-受体对 AC的抑制效应，但对δ-受体却没有相同的作用。这可能反映了不同阿片受体分子机制的差异。

G-蛋白信号转导调节子4(RGS4)基因多态性与精神分裂症的关联研究

目的：探讨G-蛋白信号转导调节子4（regulator of G-protein signaling-4，RGS4）基因与精神分裂症及临床症状的遗传关联。方法：应用病例对照关联研究设计，采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）和DNA测序方法，分析386例精神分裂症患者和390例正常对照者中RGS4基因4个单核苷酸多态性（SNP）位点与精神分裂症的关联。并采用阳性和阴性症状量表（PANSS）评估患者的临床症状，进一步分析PANSS因子分与RGS4多态性的关联。结果：RGS4基因的两个多态性位点rs12753561（T〉G，χ^2=8．970，P=0．002）和rs10759（C〉A，χ^2=13．773，F=0．002，P=0．002）与精神分裂症关联，由上述4个SNPs组成的多个单体型如AAGA（χ^2=11．120，P=0．0008，OR=0．52，95％CI=0．36—0．77）和GGGC（χ^2=10．096，P=0．001，OR=1．43，95％CI=1．15—1．79）均与精神分裂症关联。PANSS量表的阴性症状因子分与rs12753561（t=2．216，P=0．029）和rs10759（t=2．543，P=0．012）关联。结论：RGS4基因多态性与精神分裂症及阴性和一般精神病理症状显著关联。

RGS4蛋白在小儿肾母细胞瘤组织中的表达及临床意义

目的分析G蛋白信号调节蛋白4(RGS4)在小儿肾母细胞瘤组织和癌旁组织中的表达差异,探讨RGS4与小儿肾母细胞瘤发生发展的关系。方法收集37例小儿肾母细胞瘤患者术后肾癌组织及8例癌旁组织,采用免疫组织化学法检测RGS4蛋白的表达水平;另收集患者手术切除新鲜癌组织及对应癌旁组织标本各8例,采用q RT-PCR和Western blot分别检测RGS4 m RNA和蛋白的表达水平。结果免疫组织化学染色结果显示,RGS4蛋白在小儿肾母细胞瘤组织及癌旁组织中均存在阳性表达,其在小儿肾母细胞瘤组织中的高表达率低于癌旁组织[37.83%(14/37)vs.87.5%(7/8),χ2=4.675,P<0.05];RGS4 m RNA在小儿肾母细胞瘤组织中的表达水平显著低于癌旁组织(1.064±0.549 vs.5.374±0.735,t=13.290,n=8,P<0.01);Western blot结果显示,RGS4蛋白在小儿肾母细胞瘤组织中的表达量低于癌旁组织(0.301±0.092 vs.0.779±0.041,t=13.424,n=8,P<0.01)。结论 RGS4在小儿肾母细胞瘤组织中表达下调,可能与小儿肾癌的发生发展有关。

甲基苯丙胺依赖大鼠纹状体RGS4和D2受体信号传导通路mRNA的表达

目的通过建立甲基苯丙胺(methamphetamine,MA)依赖大鼠模型,检测其纹状体G蛋白信号调节因子4(regulator of G-protein signaling 4,RGS4)、多巴胺D2受体(dopamine receptor D2,DRD2)、抑制性G蛋白α亚基(inhibitory G proteinα-subunit,Gαi)和丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的m RNA表达变化,探讨MA依赖对RGS4、D2信号通路的影响.方法通过腹腔注射MA,建立MA条件性位置偏爱(conditioned place preference,CPP)1周组、2周组模型,应用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)测定各组大鼠纹状体RGS4 m RNA、DRD2 m RNA、Gαi m RNA和MAPK m RNA的表达变化.结果与生理盐水对照组比较大鼠在伴药箱的平均停留时间MA依赖CPP-周组、2周组均延长,差异具有统计学意义(P<0.05),提示MA依赖大鼠CPP模型成功建立.与生理盐水对照组比较,RGS4m RNA在MA依赖CPP 1周组、2周组中表达均降低,且2周组下降趋势更明显,但差异无统计学意义(P>0.05);而与生理盐水对照组比较MA依赖CPP 2周组中DRD2 m RNA、Gαi m RNA和MAPK m RNA的表达均明显上调,差异有统计学意义(P<0.05).结论在MA依赖中,RGS4和D2受体信号通路发生变化,RGS4可能为D2信号通路的调节靶点.

闽南地区RGS4基因多态性与精神分裂症及利培酮血药浓度关联研究

目的探讨G-蛋白信号转导调节子4(regulator of G protein signaling 4,RGS4)基因多态性位点在精神分裂症患者和正常对照中的差异及其与利培酮血药浓度的关联。方法选取闽南地区精神分裂症患者132例和正常对照140名,检测患者利培酮的血药浓度以及所有被试RGS4基因rs2842029、rs6678136和rs10799897位点的基因型。结果在患者组和对照组中,rs2842029位点只有1种基因型AA;rs6678136位点具有AA、AG、GG 3种基因型,基因型和等位基因频率分布在两组中的差异均具有统计学意义(P<0.05),3种基因型患者的利培酮血药浓度、剂量校正浓度和标准化浓度差异均无统计学意义(P>0.05);rs10799897位点具有AA、AG、GG 3种基因型,基因型和等位基因频率在两组中的差异均不具有统计学意义(P>0.05),3种基因型对应的血药浓度、剂量校正浓度和标准化浓度差异均具有统计学意义(P<0.05)。男女患者利培酮血药浓度和剂量校正浓度差异不具有统计学意义(P>0.05),而标准浓度的差异为男性低于女性(P=0.002)。结论 rs6678136位点可能与精神分裂症相关,rs10799897位点可能与利培酮的血药浓度有关。

RGS4表达上调对人恶性黑素瘤细胞的M14增殖和迁移的影响

目的:明确体外RGS4基因表达上调对恶性黑素瘤M14细胞中增殖及迁移的影响。方法:体外培养M14细胞,分为对照组(转染pc DNA3.1空质粒)和实验组(转染pc DNA3.1-RGS4质粒)。RT-PCR和Western blot检测转染后RGS4 mRNA和RGS4蛋白水平的表达,CCK-8和克隆形成实验检测RGS4上调对恶性黑素瘤M14细胞增殖的影响,划痕实验检测RGS4高表达对M14细胞迁移的影响。结果:实验组细胞中RGS4 mRNA表达量是对照组的3.25×10~3倍(P<0.05),蛋白表达量是对照组的6.73倍(P<0.05)。实验组M14细胞OD值为1.33±0.07,低于对照组的1.61±0.11(P<0.05),实验组M14细胞克隆数为34±5.53,低于对照组的56±7.68(P<0.05)。实验组M14细胞迁移能力低于对照组。结论:RGS4高表达能够抑制体外恶性黑素瘤细胞的增殖和迁移,RGS4在恶性黑素瘤的发生、发展中可能发挥重要作用。

人横纹肌肉瘤细胞中RGS4基因表达受表观遗传调控的研究

RGS蛋白是G蛋白信号途径的关键调节分子之一,RGS蛋白的异常表达与多种恶性肿瘤的发展相关,其中RGS4蛋白的作用鲜有报道。横纹肌肉瘤是儿童最常见的起源于原始间叶组织的恶性肿瘤,临床病例中比较常见。以培养不同代数的横纹肌肉瘤RD细胞系为材料,分别利用RT-PCR技术及Western blot技术分析了5-Aza和TSA处理下的RGS4基因mRNA水平及蛋白质水平的表达量。同时利用ChIP试验明确了RGS4基因启动子区域结合的调控蛋白。试验结果显示RGS4基因的表达存在着表观遗传调控机理,受到甲基化和乙酰化的调控,MeCP2和HDAC2分别参与RGS4基因的DNA甲基化和组蛋白乙酰化调控,研究结果表明RGS4基因的表达与横纹肌肉瘤的产生相关,本试验为进一步研究横纹肌肉瘤的产生机理奠定了基础。

酵母双杂交诱饵蛋白RGS4融合表达质粒的构建及鉴定

目的研究糖皮质激素受体各个结构域与G蛋白信号转导负调节因子4(RGS4)之间是否存在相互作用,构建酵母双杂交系统诱饵蛋白融合质粒。方法采用RT-PCR方法扩增RGS4片断全长,酶切回收,将其连接至酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7,构建重组质粒pGBKT7-RGS4,并经酶切和测序等方法鉴定后,使用Y187酵母菌检测重组质粒的自激活现象及毒性。然后,提取酵母总蛋白,采用Westernblot方法检测重组质粒在Y187内的表达情况,以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。结果RT-PCR扩增的RGS4基因片断电泳后,大小正确,重组质粒,pGBKT7-RGS4测序结果与GenBank中RGS4基因序列比对完全正确。重组质粒pGBKT7-RGS4双酶切鉴定、体外转录翻译实验,Westernblot等方法均证实重组质粒中的RGS4基因能够正确合成RGS4蛋白。转化酵母后排除重组质粒的自激活作用。结论构建重组质粒pGBKT7-RGS4,能够在Y187内正确表达,可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用。

RGS4过表达对甲基苯丙胺依赖大鼠纹状体mGluR5信号传导通路相关蛋白表达的影响

目的 通过建立大鼠甲基苯丙胺(METH)依赖条件位置偏爱模型(CPP),研究脑纹状体内G蛋白信号调节因子4(RGS4)过表达引起的代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)信号传导通路相关蛋白表达变化,以及对大鼠CPP行为的影响。方法将大鼠随机分为正常组、生理盐水(NS)组、METH组、Ad5-RGS4-EGFP组、Ad5-EGFP组。正常组不做处理,其余各组脑纹状体分别立体定位注射磷酸盐缓冲液(PBS)、PBS、过表达腺病毒载体Ad5-RGS4-EGFP和阴性对照腺病毒载体Ad5-EGFP,分析各组大鼠CPP行为,Western blot检测脑纹状体内RGS4、mGluR5、Gαq、PLCβ1等蛋白的表达。结果 Ad5-RGS4-EGFP组CPP差值低于METH组和Ad5-EGFP组(P<0.05),高于NS组(P<0.05)。Ad5-RGS4-EGFP组RGS4蛋白表达均不同程度高于其余4组(P<0.05,P <0.01),mGluR5、Gαq表达低于METH组和Ad5-EGFP组(P<0.05),略高于正常组和NS组( P >0.05),PLCβ1表达略有变化,但差异无显著性。结论纹状体内RGS4过表达可明显缓解METH成瘾性大鼠CPP行为,机制可能与RGS4过表达后,负性调控mGluR5介导的Gαq及PLCβ1信号传导通路相关。

甲基苯丙胺依赖对大鼠纹状体RGS4和mGluR5受体信号传导的影响

目的:研究甲基苯丙胺依赖不同时间对大鼠脑纹状体内G蛋白信号调节因子4(regulator of G-protein signaling 4,RGS4)和代谢型谷氨酸受体5(metabotropic receptor 5,m GluR5)信号传导的影响。方法:建立大鼠甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)依赖一周组(1W)、两周组(2W)模型,Western blot技术检测大鼠纹状体内RGS4、m GluR5、G蛋白α亚单位蛋白Q(Gαq)、磷脂酶C-β1(phospholipase C-β,PLCβ1)表达水平。结果:METH依赖1W、2W组伴药箱停留时间比生理盐水对照组增加,提示METH依赖模型建成。模型组大鼠纹状体内RGS4蛋白表达水平较生理盐水对照组相比明显下调,而模型组m GluR5蛋白和Gαq蛋白、PLCβ1蛋白表达与生理盐水对照组比较均有不同程度上调,且2W组较1W组改变更明显。结论:METH给药可能导致大鼠脑纹状体内RGS4表达下调,m GluR5表达上调,还可使与m GluR5偶联的Gαq、PLCβ1表达均出现不同程度上调。且METH依赖时间越长,RGS4、m GluR5、Gαq、PLCβ1的表达水平变化越显著。

RGS4和D2受体信号通路相关分子在甲基苯丙胺依赖CPP大鼠纹状体的表达变化

目的:研究甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)依赖条件性位置偏爱(conditioned place preference,CPP)实验大鼠纹状体G蛋白信号调节因子4(regulator of G-protein signal 4,RGS4)和多巴胺D2受体(dopamine receptor D2)信号通路相关分子的表达变化。方法:建立METH依赖CPP大鼠1周组、2周组,应用蛋白质印迹(Western blot)测定各组大鼠纹状体RGS4和D2、抑制性G蛋白α亚基(inhibitory G proteinα-subunit,Gαi)、丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)蛋白表达的变化;应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定各组大鼠纹状体环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量的变化。结果:与生理盐水对照组相比,METH依赖1周组、2周组大鼠在伴药箱的平均停留时间明显延长(P<0.05)。与生理盐水对照组相比,RGS4蛋白在METH依赖1周、2周组的表达均明显下降(P<0.01),且与METH依赖1周组相比,2周组的下降更为明显(P<0.05);与生理盐水对照组相比,D2、Gαi、MAPK蛋白以及cAMP在METH依赖1周、2周组的表达均明显升高(P<0.01),且与METH依赖1周组相比,2周组的升高更为明显(P<0.05)。结论:在METH依赖的CPP大鼠纹状体中,RGS4和D2受体信号传导通路相关分子发生了改变,RGS4可能参与了METH依赖的CPP大鼠纹状体D2受体信号传导通路的调节。

Gαq介导的信号通路增强RGS4蛋白表达

RGS(regulators of G protein signaling)是G蛋白偶联信号通路中一类重要的调节蛋白,通过加速Gα结合的GTP水解,即GAP(GTPase activating protein)活性,来中止G蛋白信号通路。RGS4是RGS蛋白家族中的重要成员之一,它能有效中止Gαq介导的信号通路。作者研究了Gαq蛋白对RGS4蛋白的表达调控。当在HEK293细胞中共转染这两个蛋白时,持续性激活的Gαq能特异性地显著增加RGS4蛋白的表达。蛋白降解实验结果证明这种增强作用与RGS4的降解被抑制无关,而与RGS4 mRNA表达增强有关。进一步克隆RGS4蛋白的启动子区域并研究其与RGS4表达相互关系的实验结果又表明,持续性激活的Gαq能够显著增强RGS4启动子区的转录活性,且具有时间和浓度效应。同时,转录因子结合区突变体实验证明,ICE(inverted CCAAT box element)转录因子结合区的突变显著影响RGS4基因的转录活性。以上结果表明Gαq可能通过RGS4的启动子区调控其基因的表达,促进RGS4蛋白表达。

RGS4蛋白在肝癌组织中的表达及临床意义

目的 检测G 蛋白信号调节蛋白RGS4 在肝细胞肝癌组织中的表达,研究RGS4 在肝癌和癌旁肝组织中的表达差异,分析RGS4 与肝癌临床病理特征的关系.方法 收集75 例肝癌患者术后肝癌及癌旁正常肝组织,采用免疫组织化学染色、Western blot 方法检测RGS4 蛋白的表达水平,分析其与肝癌临床病理的关系.结果 免疫组织化学结果显示,RGS4 在癌旁肝组织中表达较高,在肝癌组织中下调表达,差异有统计学意义（P〈0.05）;Western blot 检测结果与免疫组化结果一致.经过分析发现RGS4 在肝癌组织中的低表达与患者的性别、年龄、肿瘤的大小、TNM 分期及肝癌的侵袭转移无显著相关,但高分期肝癌组织中RGS4 的下调率更高.结论 RGS4 在肝癌组织中异常的低表达,可能与肝癌的发生发展相关,也可能是潜在的肝癌分子诊疗靶点.

精神分裂症与神经调节素1、G72及G-蛋白信号转导调节子4基因的关联研究

目的 探索神经调节素1（NRG1）、G72、G-蛋白信号转导调节子4（RGS4）基因变异的独立或联合作用与精神分裂症的关联。方法 采用酶切或测序方法,对315例精神分裂症患者和347例正常对照者NRG1、G72、RGS4基因的13个单核苷酸多态性（SNPs）位点进行基因型检测和遗传关联分析。应用Lo-gistic回归分析和风险或保护基因型分层后卡方检验评估三基因的交互作用。结果 单位点关联分析发现,NRG1的5个SNPs、G72的1个SNP、RGS4的2个SNPs与精神分裂症关联（P〈0.05）。Logistic回归分析构建了三个基因交互作用模型,各自变量的OR分别为：nrg1=3.58,rgs4=1.24,g72_rs947267=1.45,nrg1＊rgs4=3.03,nrg1＊g72_rs947267=1.06。应用基因型分层后卡方检验表明,三基因存在协同风险效应（OR=2.35～4.05;P〈0.05）。结论 NRG1、G72及RGS4基因的单独或交互作用与精神分裂症关联。

《西南军医》2009年第11卷总目次

论著 RGS4在HUEVCs凋亡中的作用及地塞米松对其的影响……陈星云 赵艳 李平等（1）正交试验法优化治伤灵口服液制备工艺……于波涛 姜云平 张勤等（4）甲状腺恶性肿瘤的超声特点分析……李建萍 刘容 张翊等（6）巯基受损对内皮细胞NO系统的影响……孙静 杨琴 刘漪沦（8）