毛细管离心技术在RhD抗原混合外观患者D抗原鉴定中的应用

目的探讨毛细管离心技术在RhD抗原呈混合外观患者D抗原鉴定中的应用可行性。方法对11例RhD抗原呈混合视野的患者红细胞进行清洗,制备压积红细胞。之后用毛细管离心法分离血细胞,分别向近端患者自身红细胞和远端红细胞加入抗D试剂鉴定RhD抗原。根据献血者代码追踪输入红细胞的RhD抗原。结果经毛细管离心,1例患者RhD抗原阴性,8例患者RhD抗原阳性,其余两例患者RhD抗原仍为混合视野。结论毛细管离心技术可有效分离患者新生红细胞,准确鉴定患者RhD抗原,为临床输血提供安全保障。

1例RHD-CE(3-7)-D基因重组与RHCE变异型患者的血清学与分子生物学分析

目的 研究分析1例Rh血型弱D、弱cE患者的血清学与分子生物学特征,为该类患者的临床安全输血提供实验依据。方法 采用微柱凝胶卡法对患者红细胞进行ABO、RhDCcEe抗原的鉴定,同时采用试管法进行血型复核,抗人球蛋白卡法筛查不规则抗体;采用PCR-SSP法对RhDCcEe(RhD、RhC、Rhc、RhE、Rhe)基因型进行检测;三代全长测序技术对RHD/RHCE基因序列进行测序分析。结果 微柱凝胶卡法鉴定ABO、RhD、RhCcEe血型抗原的结果为:A抗原(-)、B抗原(-)、RhD(1+)、RhC(4+)、Rhc(1+)、RhE(1+)、Rhe(4+)、对照孔(-);试管法ABO、RhD、RhCcEe抗原鉴定该患者表型为:A抗原(-)、B抗原(-)、RhD(w+)、RhC(4+)、Rhc(w+)、RhE(w+)、Rhe(4+),对照管(-);抗人球蛋白卡法筛查患者不规则抗体阴性;PCR-SSP法血型基因分型RhDCcEe结果:RhD(+)、RhC(+)、Rhc(+)、RhE(+)、Rhe(+);RHD/RHCE基因结果:RHD单倍体1为外显子1-10全缺失,而单倍体2为外显子RHD-CE基因重组融合,且确认其重组类型为RHD-CE(3-7)-D,起点在外显子2(g.20238-20312之间),终点在外显子8(g49184-50480之间),同时RHCE基因第6外显子存在新碱基点突变RHCE*cE(827C>A)。结论RHD-CE(3-7)-D基因重组融合与RHCE*cE(827C>A)新等位基因突变可能引起D、cE血型抗原弱表达,为临床安全输血提供了重要的实验数据支持。

RhD抗原表达强度对输血相容性检测低值阳性质控品制备的影响

目的通过血清学结果比较RhD抗原表达强度差异,确定低值阳性质控品弱凝集强度的基准红细胞。方法以1500倍稀释抗-D分型试剂,使用微柱凝胶法对RhD(+)红细胞进行检测,挑选RhD抗原表达强度弱和强的标本分别为低值阳性质控品弱凝集强度的基准红细胞并进行验证。结果使用稀释后抗-D分型试剂对10份RhD(+)红细胞进行检测,其中8份凝集强度为1+、2份为±。以凝集强度呈1+的红细胞为基准,确定其凝集强度呈1+时抗-D分型试剂倍比稀释的最大稀释倍数,作为低值阳性质控品制备标准,则其与RhD抗原表达强度低的红细胞反应凝集强度极弱呈±,难以保障其控制界限性质稳定。以凝集强度呈±的红细胞为基准,重新确定其凝集强度呈1+时抗-D分型试剂倍比稀释的最大稀释倍数,作为低值阳性质控品制备标准,结果符合质控品设置要求。结论以RhD抗原表达强度低的红细胞为基准,设置低值阳性质控品弱凝集强度,可避免质控品因靶值较低而造成失控。

微柱凝胶检验法在RhD、ABO血型抗原鉴定中的应用价值分析

目的探讨微柱凝胶检验法在RhD、ABO血型抗原鉴定中的应用价值。方法120例需行RhD及ABO血型鉴定患者,将所有取得的血样分为两份,分别使用试管法及手工微柱凝胶免疫检验法(微柱凝胶检验法)对血型进行分析。比较两种检测方式的鉴定结果。结果120例患者血样经试管法及微柱凝胶检验法检测后,结果均发现ABO阳性112例(其中A型34例,B型33例,AB型11例,O型34例),ABO阳性率为93.33%;RhD阴性1例,RhD阴性率为0.83%。两种方法的抗原检测结果符合率为100.00%,两种方法检测血型结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论微柱凝胶检验法应用在RhD、ABO血型抗原鉴定中,操作简便,准确率高,值得在临床中推广应用。

RhD抗原鉴定技术在临床输血中的应用效能及安全性研究

目的:研究不同RhD抗原鉴定技术在临床输血中应用效能及安全性。方法:选取2021年7月—2023年2月济南市章丘区人民医院需要输血的患者1126例作为研究对象,进行血清学试验及RhD抗原鉴定。对微柱凝胶抗球蛋白法(MGCT)、凝聚胺法(MPT)、盐水法的效能进行比较,使用受试者工作特征曲线分析三种检测方法的效能。结果:谱细胞检测RhD抗原(Rh+)1115例,无RhD抗原(Rh−)11例。MGCT的Kappa值为0.816,与谱细胞检测一致性最高。MGCT曲线下面积>MPT、盐水法,MPT曲线下面积>盐水法。结论:三种RhD抗原鉴定技术中,MGCT在RhD抗原鉴定中表现最佳,有利于保证临床输血安全。

RhD双群患者的血清学及分子生物学分析--附1例报道

目的对1名配血困难的RhD双群(double population,DP)患者进行血清学及分子生物学分析,解决其RhD血型鉴定及临床用血问题。方法用毛细管离心法分离患者红细胞,对近心端、远心端红细胞分别进行ABO和Rh血型鉴定,以及直接抗人球蛋白试验;对患者血浆进行不规则抗体筛选及鉴定以及交叉配血试验;采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测RHD基因合子型,采用序列特异性聚合酶链反应(PCR-SSP)进行RHD和RHCE基因型检测。结果血型鉴定的结果显示该患者血型为B型,RhD及RhCE的c和E血型抗原均为DP,直抗阳性,抗体筛查及鉴定结果显示血浆中含有抗-D;PCR-RFLP结果显示该患者RHD基因盒子型为D-/D-纯合子,即为RHD编码基因缺失型所致的RhD阴性;PCR-SSP的结果也显示该患者RHD编码基因外显子均缺失,RHD基因型为RHD*01N.01/01N.01,RHCE基因型为Ccee。结论本例患者在急救情况下输注了RhD阳性血液,之后被误判为RhD阳性血型,实则为RhD阴性血型。本中心在血型鉴定为DP时,利用分子生物学方法对患者进行了Rh血型准确鉴定,为该患者的精准临床用血提供了依据。

RHD基因的克隆及其在K562细胞中的表达

本研究目的在于克隆人类红细胞RHD基因,构建RhD表达载体,观察其在K562细胞中的表达。从脐血网织红细胞中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应扩增RHD/CE基因,扩增产物通过TA连接克隆到pGEMT质粒,采用测序方法筛选多个克隆获得RHD基因。将获得的RHD基因进一步亚克隆构建pcDNA3.1(-)表达载体,重组表达载体通过superfect试剂盒转染K562细胞,最后观察K562细胞中RHD基因的转录和表达。结果表明:成功分离克隆到RHD基因,构建的pcDNA3.1(-)重组表达载体经酶切和测序证实RHDcDNA序列及插入方向正确。转染后的K562细胞内有相应的mRNA转录,细胞表面有RhD抗原表达。结论:RHDcDNA转染的K562细胞能表达RhD抗原,该表达体系有助于进一步研究各种RhD变异型的分子基础。

RhD初筛阴性孕产妇RHD基因表型相关研究

目的研究不同RhD基因型与抗-D产生的相关性,以发现与产生抗-D及能引起Rh血型新生儿溶血病(HDN)相关的D基因表型。方法应用血清学方法结合分子生物学(PCR-SSP)技术。结果 RhD初筛阴性样本128例,再行RhD阴性确认试验,有3例样本阳性,为D变异型。根据分子生物学结果表明缺失RHD基因104例;DEL型21例;弱D15型2例;DⅥ型Ⅲ型1例。结论应对RhD抗原初筛试验阴性的个体进一步鉴定RHD基因型,以预测与评估产生抗-D的可能性,从而对孕产妇进行孕期指导、监测及产后干预。

RhD阴性血型抗原分析在临床输血安全中的应用研究

目的从临床输血安全的研究角度,实施有效的管理和应用,指导对RhD阴性血型稀有血液资源的保存与实用性稀有血型库的建立。方法采用瓷板法对RhD抗原进行初筛,RhD初筛阴性的血液标本,用间接抗人球蛋白法(IAT)进行确认试验;RhD确认阴性的试验标本再进行吸收和放散试验;再用盐水试管法对RhC、Rhc、RhE和Rhe抗原的鉴定。结果从165 041名献血者初筛出651名RhD抗原阴性者,其中RhD阴性抗原确认为633名,弱D型为18名,在633名RhD抗原阴性献血者中,ABO血型分布为:O型(36.81%)(A型(30.49%)>B型(26.07%)(AB型(6.63%);RhD阴性血型抗原表现型以ccdee(59.08%)和Ccdee(30.96%)居多,其次为CCdee、ccdEe、CcdEe、CCdEe、CcdEE和ccdEE表现型,未见CCdEE表现型。从整体随机抽取确认为阴性的316名献血者中共检测出DEL型71名,所占比例为22.47%。结论把O型CCdEE和ccdEE表现型红细胞,在工作中发现后及时冻存并在临床上针对使用,在建立使用型稀有血型库和解决临床对特殊血型的需求具有实际的临床应用意义。

单采血小板输注RhD抗原引起的同种免疫作用及其临床应用

目的研究单采血小板(APC)输注中由RhD抗原引起的同种免疫频率及其临床应用效果。方法在没有预防性应用Rh免疫球蛋白的情况下,给予RhD阴性的血小板减少症出血患者RhD阳性血小板,测定输注前及输注后1h的外周血血小板计数(BPC),计算校正血小板增加值(CCI)来评估临床疗效;在接下来的随访中,以低离子强度间接抗球蛋白试验检测每份标本的抗-D水平,计算同种免疫频率。结果输注后27例患者出血症状均得到明显缓解,输注后1h的CCI为(12.7±1.2)×109/L;输注RhD不合血小板引起的同种免疫频率为3.7%。结论输注RhD不合APC临床疗效明显,引起同种免疫反应几率很低,在紧急情况下可给予RhD阴性患者RhD阳性的APC。

马来酰亚胺苯甲胺酯聚乙二醇遮盖红细胞RhD抗原研究

[目的]马来酰亚胺苯甲胺酯聚乙二醇(MDPEG)修饰红细胞,遮蔽RhD抗原,使Rh+红细胞转变为Rh-红细胞。[方法]甲基苯甲酸和聚乙二醇单甲醚(分子量5000)为原料合成MDPEG(分子量5910)。红细胞修饰:3%～5%RBC+MDPEG+2-亚氨基硫烷(IT)、pH 7.4、室温2 h。盐水法进行红细胞与ABO血型、RhD血型血清学实验。血流变仪测定红细胞黏度等指数。盐水梯度法测定红细胞渗透脆性。[结果]30 mg/ml马来酰亚胺苯甲胺酯聚乙二醇能有效遮蔽3%～5%红细胞RhD抗原,红细胞与抗RhD抗体无凝集反应,光学显微镜观察红细胞无聚集,细胞形态正常。红细胞膜渗透性、红细胞聚集指数轻微升高,刚性指数轻微下降。[结论]马来酰亚胺苯甲胺酯聚乙二醇(MD-PEG)能完全遮盖RhD抗原,获得RhD阴性红细胞,细胞形态,结构正常。

流式细胞术检测RhD抗原及其临床应用

目的 探讨流式细胞术 (FCM)检测RhD抗原及其临床应用价值。方法 选取标准的RhD(- )和RhD(+)细胞按 9个不同比例混合 ,分别用直标法 (FITC 抗 D)和间标法 (抗 D和FITC 抗 IgG)染色 ,在FCM上作细胞相对和绝对计数。选择合适检测条件 ,对 2名RhD(- )患者误输RhD(+)红细胞后作RhD(+)细胞计数。结果 与间标法相比 ,直标法检测结果更接近理论值。而单平台和双平台计数法与理论值间无显著性差异 (F =0 .0 32 5 ,P >0 .0 5 )。对 2名RhD(- )的 3份不同时间样本检测发现 ,RhD(+)细胞相对计数分别为 4 .73%、1 0 .87%和 2 0 .86 % ,绝对计数分别为 0 .1 2 4× 1 0 1 2 /L、0 .2 4 5× 1 0 1 2 /L和 0 .5 1 7× 1 0 1 2 /L。结论 FCM能检测RhD(- )细胞中不同浓度的RhD(+)细胞 。

江西地区RhD阴性个体的RHD基因与RhCcEe抗原的表达分析

目的调查江西地区RhD表型确认为阴性者的RhCcEe表型与RHD基因型间的关系,确认RHD基因的外显子模式对RhCcEe抗原表达的影响。方法血清学直接凝集法检测D、C、c、E、e抗原,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认RhD阴性血型,对IAT确认为RhD抗原阴性的样本,随机抽取111例,使用PCR-SSP法行RHD基因分型。结果 464例标本中,确认为RhD阴性者451例(97.1983%),RhD变异性13例(2.8017%),111例确认RhD阴性的标本中,共检出六种RHD基因型,包括RHD(-)5例,RHD-CE(2-9)-D 71例,DVI III 1例,DEL RHD1227A 12例,弱D152例,RHD(+)20例,血清学上,111例标本中共检出ccee61例(54.96%),Ccee36例(32.43%),CCee8例(7.21%),CcEe和ccEe各3例(2.70%)。结论 RhD阴性人群中RHD基因序列的不同影响RHCcEe各表型的表达。

3例弱D表型献血者的RhD抗原表位和分子机制研究

目的研究3例RhD抗原表型为弱D型54的献血者的RhD抗原表位和分子机制。方法采用常规试剂对3例弱D型54样本进行Rh分型,并采用D-screen分析样本的RhD抗原表位。对RHD基因全部外显子测序并分析RHD基因杂合性。使用Robetta服务器进行模型构建。结果 2例样本仅检出365C>T突变,1例样本检出365C>T杂合突变和1 227G>A杂合突变。经D-screen中全部抗体检测的2例样本表现出与部分D表型中DVII相同的D抗原表位分布,另1例未经D-screen全部抗体检测的样本与DVII的D抗原表位分布类似。同源建模分析显示弱D型54的胞内S122L突变也可能影响D抗原胞外区的蛋白结构。结论首次在中国人中报道了弱D型54,并首次分析了该表型的D抗原表位组成。弱D型54具有部分D表型的特征,可能引起同种免疫。

RhCE表型对RhD抗原量及抗-D效价测定的影响研究

目的目前对Rh系统抗-D的定量或效价检测(相对定量)方法皆依赖于试剂红细胞。日常工作中,绝大多数实验室采用单人份红细胞作为效价测定的试剂红细胞,若RhCE表型对RhD抗原表达量影响显著,则不同RhCE表型必然会产生不同的抗-D效价测定结果。本研究旨在通过RhCE分型,RhD抗原定量试验及相应抗体进行效价测定,比较分析RhCE表型对RhD抗原量及抗-D效价测定的影响。方法采用血清学方法筛选获得CCee、Ccee、ccEE、CcEe表型的RhD阳性标本,并使用流式细胞术检测上述红细胞RhD抗原量,最后使用不同RhCE表型单人份标本红细胞对同一份抗-D进行效价测定。分析RhCE表型对RhD抗原量及抗-D效价测定的影响。结果在99例细胞红细胞标本进行Rh血型血清学分型后,对CCDee(n=17)、CcDee(n=15)、CcDEe(n=8)、ccDEE(n=8)分型细胞进行流式免疫荧光检测,发现CcDee与ccDEE及CcDEe间、CCDee与ccDEE之间RhD抗原的荧光量比较存在较大统计学意义差异(P<0.001),CcDee与CCDee比较存在统计学意义差异(P<0.01),其余各组间均不具统计学意义的差异;再对其中CCDee(n=15)、CcDee(n=14)、CcDEe(n=8)、ccDEE(n=8),使用同1份抗-D血浆进行效价测定分析,将效价结果与红细胞RhD抗原免疫荧光值(MFI)进行比较后,发现红细胞表面RhD抗原量与效价二者呈现正相关关系(r=0.907;P<0.001),对效价与RhD抗原MFI值进行统计分析发现:对同一份抗-D血浆,效价值为32、64、128各组内红细胞MFI具有统计学意义的差异(P<0.05);将效价与RhCE分型进行统计分析,发现CCEE与Ccee间、CcEe与Ccee间存在统计学意义的差异(P<0.05)。结论不同的RhCE表型会造成D抗原表达差异,D抗原量对效价测定有较大影响,提示在效价测定试验中,使用相同RhCE分型红细胞作为试剂细胞或对RhD抗原进行定量分析可提高效价试验的准确度。

RHD1227A型弱D的D抗原表位分析

目的分析携带RHD1227A等位基因的Rh血型弱D型个体的红细胞D抗原表位。方法采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,并检测RHD杂合型。对确认的弱D型,使用12种抗-D抗原不同表位的单克隆抗体,分析红细胞D抗原表位。结果血清学筛选和PCR-SSP检测鉴定出3例携带RHD1227A等位基因的弱D型样本,Rh小因子均为C+c+E-e+,RHD合子型鉴定均为RHD+/RHD-杂合型,提示3例个体基因型为CDe/cde。3例个体红细胞D抗原表位分析显示均具有基本完整D抗原表位,与Rh(D)阳性对照样本相同。结论发现3例RHD1227A型弱D型;不管RHD1227A等位基因表达DEL型或弱D型,其D抗原表位近似,均表达基本完整D抗原,提示该等位基因不同量的表达可能与其它调节因素有关。

mPEG-SPA修饰人红细胞RhD血型抗原的研究

目的观察mPEG-SPA(甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯)对人红细胞RhD血型抗原修饰的效果,并探讨mPEG-SPA修饰的可行性。方法采用mPEG-SPA修饰人红细胞血型RhD抗原,并观察其对红细胞形态、结构和功能的影响。结果 2.0 mmol/L的mPEG-SPA在pH8.0室温条件下可有效遮蔽红细胞表面RhD抗原,且与红细胞结合牢固,对红细胞的形态、渗透脆性、自身溶血率、红细胞膜胆固醇含量、乙酰胆碱酯酶活性、Na+-K+ATP酶活性、2,3-DPG含量、血沉值、变形指数和常规指标均无明显影响。结论采用2.0 mmol/L mPEG-SPA遮蔽人红细胞RhD抗原获得了初步成功。

产生抗D的DVI type 3型孕妇免疫血清学和RHD基因型分析

目的:对部分D表型孕妇进行免疫血清学和RHD基因型分析。方法:采用常规血型血清学方法鉴定孕妇RhD血型,并进行血型特异性抗体筛查和鉴定;采用序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reactionsequence specific primer,PCR-SSP)鉴定孕妇RHD基因型;采用多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligationdependent probe amplification,MLPA)对孕妇及其配偶和女儿的RhD血型抗原进行基因分型及遗传分析。结果:该孕妇血清中检测出IgG抗-D,其抗体效价为1∶8。PCR-SSP结果显示,该孕妇RHD基因第3-6外显子缺失,经鉴定该孕妇RHD基因型为DVI type 3型。MLPA分析显示,该孕妇只有1条RHD等位基因,且缺失3-6外显子,其基因型为CDVIe/cde,其配偶为CDe/CDe纯合子基因型,女儿为CDe/CDVIe基因型。结论:准确的RhD血型鉴定对制定安全有效的临床输血策略和对育龄妇女采取恰当措施及预防新生儿溶血病具有重要意义。

RhD阳性血影细胞的制备及应用

目的:探讨用不同渗透浓度磷酸盐液(PB)制备的RhD阳性血影细胞的抗原性及其在抗-D抗体分离中的作用。方法:用不同渗透浓度PB作为裂解液,将遗传表现型为CCDee的RhD阳性O型红细胞制备成血影细胞,观察其抗原性;以血影细胞为固相抗原,用亲和层析法从抗D含量为0.814 mg/L的健康人血浆中分离抗-D抗体,检测相关指标。结果:pH7.4、30 mmol/L PB制备的血影细胞形态完整,保持较强的抗原性;成功获得抗-D抗体,回收率达到84.65%,IgG单体加二聚体含量为99.3%,不含抗A、抗B血型抗体以及IgA、IgM和血红蛋白。结论:用pH7.4、30 mmol/L PB制备的血影细胞可作为固相抗原,并能从低效价血浆中分离纯化抗-D抗体。