新疆地区249例RhD变异型基因分型研究

目的研究分析新疆地区RhD变异型标本的RHD基因分型特征。方法收集2006年1月—2023年6月常规RhD阴性确认工作中RhD抗原盐水法阴性或弱阳性、间接抗人球蛋白试验(IAT)阳性的RhD变异型标本249例,并做RhCE抗原分型,提取血液基因组DNA,采用PCR-SSP或qPCR方法对RHD基因进行分型,必要时用基因测序验证。结果249例RhD变异型标本中,检出弱D15型(RHD*15)155例(62.25%)、DⅥtype 3型(RHD*06.03.01)30例(12.05%),弱D1型(RHD*01W.1)7例(2.81%)、弱D17型(RHD*01W.17)2例(0.80%)、DⅥtype 4型(RHD*06.04)3例(1.20%)、DⅤtype 2型(RHD*05.02)9例(3.61%)、DⅢa型(RHD*03.01)1例(0.40%),以及DEL1227A(RHD*01EL.01)6例(2.41%),未能确定RHD等位基因型别,有待进一步基因测序分析的标本有36例。RHD*15的常见Rh表型为ccEe。结论新疆地区RhD变异型的RHD基因以RHD*15为最常见,并存在丰富的遗传多态性。

重庆地区RhD变异型无偿献血者的基因多态性及其表型研究

目的对重庆地区22例RhD变异型无偿献血者标本进行Rh血型血清学检测和三代基因测序,了解重庆地区RhD变异型的表型分布及其基因分型。方法选择2023年1—8月本中心参与无偿献血的人群作为研究对象。使用传统血清学方法对其进行RhD表型鉴定,确定为RhD变异型后使用D-screen试剂盒对其进行RhD不同抗原表位的检测。此外,提取其基因组DNA,使用叠瓦式引物设计进行多段扩增、拼接获得RHD基因全长序列进行三代测序检测,并用SnapGene软件对序列结果进行分析。结果在22例RhD变异型中,8例为DVI 3型(36.36%),其存在RHD-CE(3-6)-D杂交等位基因;6例部分弱D15型(27.27%),主要发生的突变为c.845G>A;6例亚洲型Del(27.27%),主要发生的突变为c.1227G>A,还有1例弱D17型发生的突变为c.340C>T和1例推测为部分D(c.491A>T,p.Asp164Val,错义突变)。结论重庆地区无偿献血人群中最常见的RhD变异型为DVI 3型,使用SMRT三代测序技术可以获得RhD变异型单倍体全长。

芜湖地区初筛RhD阴性献血人群RHD基因分型特征

目的:了解芜湖地区献血者初筛RhD^(-)汉族人群的RHD基因分型的分子机制及分布特征。方法:收集2021年8月-2022年8月芜湖市中心血站无偿献血人群初筛RhD^(-)样本共210例,对样本的RHD基因第1、10号外显子进行PCR扩增,确定样本是否存在RHD基因。对含有D基因的82例样本RHD基因1-10号外显子进行PCR扩增及合子型分析,对55例含全部RHD外显子样本进行Sanger测序以确定基因型。结果:在210例RhD^(-)标本中,128例(60.38%)为RHD基因缺失;27例存在部分RHD外显子,包括2例RHD*DVI.3/RHD*01N.01,24例RHD*01N.04/RHD*01N.01和1例RHD-CE(2-10)/RHD*01N.01;55例含有全部RHD外显子,包括4例RHD*01/RHD*01N.01,6例RHD*15/RHD*01N.01,1例RHD*01 W.72/RHD*01N.01,1例RHD*15/RHD*01EL.01,39例RHD*01EL.01/RHD*01N.01,余下4例样本根据合子型分析确定不存在RHD基因缺失、测序显示存在1227G>A突变。结论:芜湖地区献血人群RhD^(-)D基因的分子机制存在多态性,其中RHD*01EL.01和RHD*15为本地区主要D变异型,本研究结果为本地区RhD血型鉴定和临床输血提供理论基础。

RhD变异体Type33型受血者同种免疫产生抗-D合并抗-E混合抗体的研究

目的:探讨1例RhD阳性患者免疫产生抗-D合并抗-E混合抗体的原因。方法:用常规血清学方法鉴定ABO/Rh血型和不规则抗体特异性,采用序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)检测患者的RHD基因外显子1-10区域并进行杂合性分析,利用一代测序方法分析全外显子序列。结果:患者Rh血型为弱D Type33型,其RHD等位基因为RHD01W.33,患者表现为RHD+/RHD-杂合型,Rh分型为Ccee,产生了抗-D合并抗-E混合抗体。结论:该患者RHD基因外显子4发生了c.520G>A的突变,这一变异导致了红细胞上RhD抗原的表达减弱。

北京地区初筛RhD阴性人群血清学和RHD基因分型特征研究

目的研究北京地区初筛RhD阴性人群RHD基因分型,分析不同基因型的血清学特征及Rh表型分布规律。方法收集本院2022年8月—2024年1月通过微板法或微柱凝集法初筛RhD阴性标本204例,使用盐水试管法进行Rh抗原表型鉴定,微柱凝集-间接抗人球蛋白技术进行RhD阴性确认试验,PCR-SSP法和测序技术进行RHD基因分型检测,计算各表型频率和基因频率。结果204例初筛RhD阴性标本Rh血清学表型分布为ccee 112例(54.90%)>Ccee 73例(35.78%)>CCee 9例(4.41%)>ccEe 6例(2.94%)>CcEe 4例(1.96%)。本研究共检出7种RHD基因型,检出数量由高至低依次为129例(63.24%)RHD^(*)01N.01、44例(21.57%)RHD^(*)01EL.01、26例(12.75%)RHD^(*)01N.03、2例(0.98%)RHD^(*)01N.16、1例(0.49%)RHD^(*)06.03.01、1例(0.49%)weak RHD^(*)15,1例(0.49%)RHD^(*)13.01/RHD^(*)01N.01。Rh血型抗原基因频率及表型分布,符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。结论北京市初筛RhD阴性人群RHD基因具有多态性,最常见的RhD阴性基因型为RHD^(*)01N.01,RHD变异型为RHD^(*)01EL.01。该研究可为临床实施基因型匹配输血提供数据支持。

1例Del表型献血者RHD基因分析

目的:分析云南1例Del表型献血者的RHD基因型。方法:鉴定标本Rh血清学表型,对RHD基因进行PCR-SSP分型检测及10个外显子测序分析,扩增第9外显子进行克隆测序并分析序列,检测RHD基因合子型。结果:本研究病例标本Rh表型为CcD^(el)ee;RHD基因第9外显子包含第8内含子和第9内含子缺失共1003 bp,缺失发生在两个7 bp的短串联重复序列之间;其余外显子序列无变异;Rh杂交盒检测表明存在1条RHD阴性等位基因。结论:本研究病例标本为RHD基因第9外显子缺失导致的Del型。

RHD*845A/1227A变异型个体的分子机制

目的:研究1例罕见的RhD变异型个体的基因突变机制。方法:采用常规血清学方法对样本进行Rh分型,间接抗人球蛋白试验确认RhD抗原以及抗体筛查。D-screen试剂分析样本的RhD抗原表位。利用序列特异性引物聚合酶链反应法检测RHD基因以及RhD杂合型分析,Sanger测序方法分析RHD基因编码区序列。应用逆转录聚合酶链反应检测样本RHD mRNA,对RHD cDNA进行TA克隆和序列分析。结果:血清学检测该样本RhD抗原为弱阳性,Rh分型为CcDEe,抗体筛查结果为阴性。经D-screen试剂检测样本表现出部分D的抗原表位分布。经RHD基因编码序列分析发现,RHD基因第6外显子第845位和第9外显子第1227位碱基均显示G/A杂合。TA克隆得到3种剪接异构体。结论:该研究对象为RHD基因845G>A和1227G>A突变个体,该杂合突变导致样本红细胞RhD抗原减弱。

新乡地区Rh阴性无偿献血者Rh表型分布及RhD变异型基因型分析

目的分析新乡地区Rh阴性无偿献血者Rh表型分布及RhD变异型基因型。方法选择2018年1月至2019年12月于新乡市中心血站无偿献血的110667名无偿献血者为研究对象。采用试管法ABO正反定型试验检测ABO血型,采用试管法Rh抗原分型试验检测Rh表型并初筛RhD阴性受试者,采用间接抗人球蛋白试验对初筛RhD阴性受试者进行RhD阴性确认,并检出RhD变异型受试者。采用聚合酶链式反应法扩增RhD变异型受试者RHD基因外显子E1~E10,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察相应的外显子区域有无特异性条带出现。采用Sanger测序法对RhD变异型受试者的RHD基因外显子E1~E10的特异性扩增产物进行基因测序,应用SeqMan软件分析基因序列,根据单核苷酸多态性位点确定RhD变异型。结果110667名受试者中,初筛RhD阴性269例(0.24%)。269例初筛RhD阴性受试者中,Rh阴性256例(95.17%),RhD变异型13例(4.83%)。256例RhD阴性受试者中,ABO血型为A型78例(30.47%)、B型92例(35.94%)、O型64例(25.00%)、AB型22例(8.59%),Rh表型分布以ccdee(60.55%)和Ccdee(29.30%)居多。11例RhD变异型受试者的RHD基因外显子E1~E10为特异性条带,2例RhD变异型受试者的RHD基因外显子E1~E5、E8、E10为特异性条带。13例RhD变异型受试者中,7例弱D型、4例DEL型和2例部分D型。13例RhD变异型受试者RHD基因RhCE表型分别为CCee(2/13)、Ccee(6/13)和ccEe(5/13)。7例RhD变异型受试者等位基因RHD*15的E6外显子发生845G>A杂合突变。4例RhD变异型受试者的E9外显子发生1227 G>A杂合突变,其中1例受试者同时发生ZVS7+152 C>A突变。2例RhD变异型受试者的RHD基因E6~E9外显子发生突变,被RHCE基因所取代,表现为RHD-CE(6-9)-RHD。结论新乡地区RhD阴性无偿献血者中Rh表型分布以ccdee和Ccdee居多,RhD变异型以弱D型为主,其RHD等位基因为RHD*15。

秀山县3个主要民族无偿献血者ABO、RhD血型的调查

目的 为了解秀山县3个主要民族无偿献血者的ABO血型、RhD血型和基因频率,更好的制定无偿献血计划。方法 选取2012年-2019年秀山县汉族、土家族、苗族无偿献血者,剔除不符合要求的数据,利用Bernstein校正公式和赵桐茂方法计算p、q、r基因频率,|t|≤2时,P≥0.5作为无显著差异界限,检验Hardyweinberg平衡度;一般资料采用微软EXCEL 2003函数计算,组间比较采用SPSS 24.0卡方检验,P<0.05有统计学意义。结果 本次共调查9664人,汉族、土家族、苗族3个主要民族的血型表现型为O型>A型>B型>AB型,基因频率r>p>q,民族指数均>1,|t|<2,P>0.5,均满足Hardy-weinberg平衡;湘西州汉族、黔江土家族与秀山汉族、土家族比较无统计学意义(P>0.05),太原汉族、湘西州土家族、柳州苗族、湘西州苗族与秀山3个民族比较比较有统计学意义(P<0.05);RhD阴性率0.16%,不同RhD血型的ABO血型比较无统计学意义(P<0.05)。结论 秀山县汉族、土家族、苗族人群ABO血型分布和基因频率保持稳定,RhD阴性频率偏低。

福建省RhD阴性个体RHD基因多态性

为了探讨RhD阴性福建个体的RHD基因结构，设计14对序列特异性引物，应用PCR—SSP技术检测104名福建省RhD阴性献血者的RH基因型，并对部分样本进行吸收放散试验，同时对2例携带RHD基因RhD阴性样本进行DNA序列测定。结果显示，61．54％阴性福建个体完全缺失RHD基因（RHD^-／RHD^-），25．97％RhD携带RHD1227A等位基因（其中62．96％为RHD^＋／RHD^-杂合子，37．04％为RHD^＋／RHD^＋纯合子），8．65％携带RHD-CE（2—9）-D等位基因，1．92％携带RHD710delC等位基因；多数RHD基因缺失存在于dce单倍体中，发现6例RHD基因缺失存在于dCe单倍体（RH基因型为dce／dCe）中，2例存在于dcE单倍体（RH基因型为dce／dcE）中；同时检测8个RHD基因外显予以及RHD1227A等位基因，以预测RhD表型的准确性明显高于单独检测某个RHD基因外显子的准确性（Χ^2=24．43，P〈0.005）。结论：RhD阴性福建个体RHD基因具有多态性；在中国用RHD基因分型完全替代血清学检测RhD表型的条件尚未成熟。

人RHD基因Rhesus盒的检测及其意义

为了解人RHD基因的组合情况 ,进一步研究RHD基因遗传结构和预测新生儿溶血病 ,采用PCR SSP方法 ,设计 4条引物 ,用同一PCR反应条件同时检测人RHD基因的上游、下游和杂交的Rhesus盒。结果显示 :RHD- RHD- 纯合子个体只检出杂交Rhesus盒 ,无上、下游Rhesus盒 ,RHD+ RHD- 杂合子个体能同时检出上、下游和杂交Rhesus盒 ,RHD+ RHD+ 纯合子个体只检出上、下游Rhesus盒 ,无杂交Rhesus盒。 5 0例RhD阳性样本中5例 (10 % )为RHD+ RHD- 型 ,其余 (90 % )均为RHD+ RHD+ 型。 98例无血缘关系RhD阴性汉族人样本中 ,5 4例(5 5 .1% )为RHD- RHD- 纯合子 ,36例 (36 .7% )为RHD+ RHD- 杂合子即RHD基因单体型 (可用于对RHD基因单体型进一步分析 ) ,8例 (8.2 % )为RHD+ RHD+ 纯合子。 2例弱D型样本同时检出上、下游和杂交Rhesus盒 ,为RHD+ RHD- 型。 16例Del型中 10例 (6 2 .5 % )同时检出上、下游和杂交Rhesus盒 ,为RHD+ RHD- 型 ,6例 (37.5 % )只检出上、下游Rhesus盒 ,无杂交Rhesus盒 ,为RHD+ RHD+ 型。这些样本RHD基因 10个外显子的检测结果验证了本方法的正确性。结论 :本方法所需引物少 ,操作简便 ,结果判断直观 ,适合临床应用。在RhD阴性中国汉族人中存在为数不少的RHD无效基因

RHD基因的克隆及其在K562细胞中的表达

本研究目的在于克隆人类红细胞RHD基因,构建RhD表达载体,观察其在K562细胞中的表达。从脐血网织红细胞中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应扩增RHD/CE基因,扩增产物通过TA连接克隆到pGEMT质粒,采用测序方法筛选多个克隆获得RHD基因。将获得的RHD基因进一步亚克隆构建pcDNA3.1(-)表达载体,重组表达载体通过superfect试剂盒转染K562细胞,最后观察K562细胞中RHD基因的转录和表达。结果表明:成功分离克隆到RHD基因,构建的pcDNA3.1(-)重组表达载体经酶切和测序证实RHDcDNA序列及插入方向正确。转染后的K562细胞内有相应的mRNA转录,细胞表面有RhD抗原表达。结论:RHDcDNA转染的K562细胞能表达RhD抗原,该表达体系有助于进一步研究各种RhD变异型的分子基础。

cis基因交换形成RHD-CE(2～9)-D等位基因

以往通过基因组DNA分析,分别在高加索人和中国人中观察到少数Rh阴性个体存在RHD基因第1和第10外显子,但是该等位基因形成的具体分子机制尚有争论。分别针对RHD基因mRNA的5′和3′非编码区设计一对特异性引物,通过逆转录PCR(RTPCR)和cDNA测序,分析2例RHD基因阳性(拥有第1和第10外显子)、D抗原表型阴性个体的全长mRNA/cDNA序列,同时以1例正常Rh阳性个体(CcDDee)作对照。结果正常Rh阳性个体拥有正常RHD基因mRNA,2名携带RHD基因的Rh阴性个体则均检出存在与正常RHD基因或RHCE基因转录产物相同长度、以及相同外显子构成的mRNA,但该转录子的第1和第10外显子及3′非编码区序列与RHD基因一致,而第2～9外显子全部序列与RHCE(e)基因mRNA相同,表明2名个体均存在RHDCE(2～9)D融合RHD等位基因,即其RHD基因的第2～9外显子被同源RHCE(e)基因替换,导致不能编码正常RhD蛋白,形成个体D抗原阴性表型。

鉴定9个新的RHD基因mRNA可变剪接体

为了研究各种RHD基因mRNA可变剪接体的基因结构，应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测正常人脐血样本RHDmRNA，对RHDcDNA进行TA克隆和序列分析，对各可变剪接体的剪接位点进行DNA序列分析，并将RHDmRNA进行表达序列标签（ESTs）分析。结果在28个阳性克隆中，除全长RHDcDNA外，共检测到12种（包括9种新的）RHD可变剪接体，发现外显子遗漏、5’和3’剪接位点变异3种剪接形式，涉及外显子2～9，其中6种新的剪接体同时存在RHD和RHCE基因同源杂交现象。ESTs分析还检索到内含子保留形式的剪接体。研究表明，RHD基因mRNA存在复杂的可变剪接机制，除己报道的剪接体外，检测到9种新的RHD可变剪接体，并发现了可变剪接和同源杂交并存现象。

中国人特异性的RHD基因定型方法的建立

目的 建立特异性针对中国人的RHD基因定型方法。方法 设计6对特异性针对中国人RHD等位基 因的引物,并引入1对内对照引物,建立PCR 序列特异性引物(PCR- SSP)方法,分6个反应管检测RHD基因。采 用这一方法检测经血清学鉴定和RHD全基因序列分析的88份中国汉族人Rh阴性样本,13份Rh阳性、弱D型和 部分D表型样本,以及28份D放散型(Del)样本,同时对318名随机无偿献血者作RHD基因定型,然后与血清学检 测结果比较。结果 所有样本的PCR SSP检测结果均与血清学结果一致(符合率100%),并可指示目前在中国人 中观察到的全部RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因(或称无效等位基因),同时还可检出Del表型及存在于Rh阳 性个体中的Del等位基因(RHD1227A)即RHD/Del杂合型(或RHD/RHD1227A);对318名随机个体的RHD 基因检测显示后者在中国人群中的比例为8/318,Del基因在中国人群中频率即为0.012579。结论 上述PCR-SSP 方法简便、快速,且具有较高的准确率,可用于临床或科研进行中国人RHD基因定型或遗传分析。

中国人群RhD阴性个体中D基因多态性的研究

目的 建立 RHD基因分型技术 ,分析中国人群 Rh D阴性个体的 RHD基因多态性分布状况。方法 设计 8对特异性引物扩增 RHD 7个外显子 ( 3 ,4,5 ,6,7,9,1 0 )和内含子 4,应用 PCR-SSP技术 ,对 1 1 5例经常规血清学试验和吸收放散试验鉴定的“Rh阴性个体”,进行 D基因多态性的研究。结果 1 1 5例 Rh D阴性个体 ,用吸收放散试验检测后分成 2组 ,一组被确认为 Rh D阴性表现型共 88例 ( 76.5 % ) ,另一组是 Del(放散 )表现型共 2 7例 ( 2 3 .5 % )。应用 PCR-SSP法对1 1 5例 Rh D阴性个体作 RHD内含子 4检查 ,结果 Del型个体都显示有 RHD内含子 4;对 1 1 5例中的 1 7例进一步作 RHD的 7个外显子的鉴定 ,其中 6例 Del带有完整的 RHD基因 ,1 1例经吸收放散试验确认为 Rh D阴性表现型的个体则显示 4种情况 :7例全部缺失 RHD基因 ,2例 ( 1例 cc Ee和 1例 Ccee)带有完整的 RHD基因 ,1例缺失 RHD的第 5外显子和 1例仅携带第 1 0外显子。结论 PCR-SSP技术可用于 RHD基因的研究。常规血清学鉴定的 Rh D阴性者中存在较高比例的 Del型 ,且有可能带有完整的 RHD基因。而被吸收放散试验确认为 Rh D的阴性个体有可能携带 RHD基因并显示出多态性 ,这些个体中有 Rhc抗原表达者 ,有别于文献中认为全属 Rh C抗原表达者的报?

多重PCR-SSP方法在RHD基因检测中的应用

目的应用分子生物学诊断方法分析RhD阴性献血者的RHD基因。方法首先采用多重PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)方法扩增377名RhD阴性无偿献血者的RHD基因特异性内含子4和外显子7,对扩增结果为阴性的标本则继续采用PCR-SSP检测RHD基因启动子和外显子10。结果 337名RhD阴性无偿献血者中,24.92%(84/337)为RHD基因内含子4和外显子7阳性,余253例内含子4和外显子7阴性标本中的8.69%(22/253)为启动子和外显子10阳性;本组RhD阴性无偿献血者的RHD基因阳性率为31.45%(106/337)。结论多重PCR-SSP方法检测RHD基因简单易行,可用于对血清学RhD阴性者的RHD基因确认。