密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。

中国首例兔出血症病毒2型(RHDV2/b/GI.2)的鉴定及病理学观察

本试验旨在鉴定四川金堂某兔场疑似兔出血症病毒2型(RHDV2)感染疫情的病原,并分析病兔的病理组织学变化。利用血凝试验和RT-PCR检测病死兔内脏组织中的病原,取病变组织制作病理切片,观察分析各组织的病理组织学变化,同时应用病兔肝脏悬液感染幼兔,分析该毒株的致病力。血凝试验结果显示,所采集病死兔肝脏样品能凝集人“O”型血红细胞;RT-PCR扩增及测序结果显示,多对引物均能从样品中扩增出RHDV2特异性条带;病理组织学观察结果显示,病兔多脏器严重出血、肿胀,淋巴细胞和中性粒细胞大量浸润,气管黏膜、肝脏、肺脏出血尤为严重;动物试验结果显示,该毒株毒力较强,含毒肝脏悬液能在24 h内迅速致死幼兔。本研究经临床诊断、核酸检测及测序证实了此次疫情确由RHDV2感染引起,动物试验和病理组织学观察表明该毒株毒力较强,可引发脏器严重出血,造成病兔急性死亡,RHDV2的出现提示病毒的跨境传播情况不容乐观,应引起更大的重视。

新型兔出血症病毒(RHDV2)VP60蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为了表达含有新型兔出血症病毒(RHDV2)衣壳蛋白VP60基因的重组蛋白,利用合成的含VP1基因的质粒pUC-VP60为模板,通过PCR扩增获得VP60基因,并将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-32a(+)-VP60。转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达VP60重组蛋白,纯化重组蛋白并免疫小鼠,制备抗VP60的多克隆抗体。Western-blot分析和间接免疫荧光试验检测结果显示,该抗体具有良好的免疫原性。本试验成功制备的VP60蛋白及多克隆抗体,为预防RHDV2及RHDV2 VP60的功能研究奠定了良好基础。

Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP 60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3895和1752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带;IFA观察结果显示,感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光,表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白,且该蛋白具有良好的抗原性;病毒滴度测定结果显示,初代重组腺病毒的TCID_(50)为10^(5.5)/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP 60基因的重组腺病毒,并成功表达了RHDV2 VP60蛋白,为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。

兔出血症病毒2型的分离鉴定与序列分析

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种具有高度传染性、急性致死性兔病。兔出血症病毒2型(RHDV2)引起的RHD主要在欧洲流行,病兔的死亡率高达90%,而用经典RHDV毒株制备的疫苗几乎不能预防家兔感染RHDV2,从而给世界养兔业造成了巨大的经济损失。2020年4月,中国四川省某兔场首次发生由疑似RHDV2引起的RHD,笔者所在实验室通过红细胞凝集试验(Hemagglutination,HA)、逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增、vp60基因序列分析和病毒复制试验,对采集的病死家兔肝脏样本进行病原鉴定。HA结果显示,部分病死家兔的肝脏样本不能引起血凝现象;RT-PCR结果显示,样品中出现了RHDV2的特异性条带。对新发现毒株cDNA的RT-PCR产物进一步分析发现,所扩增vp60基因核苷酸序列与经典RHDV vp60基因核苷酸序列的一致性为77.5%~80.1%,与RHDV2 vp60基因核苷酸序列的一致性为93.6%~96.1%,并且与RHDV2处于同一个进化分支。病毒复制试验结果显示,用病死家兔肝脏组织与磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)按1 g∶10 ml混合后制成的悬液分别人工感染5只非免疫25日龄未断奶仔兔和5只2月龄兔,在24~48 h全部死亡。基于以上试验结果,确定本研究新发现的RHDV毒株为RHDV2,并将其命名为SC2020,这是在中国首次发现RHDV2毒株,应引起高度重视。

兔出血症病毒经典毒株和变异毒株的RT-PCR鉴定

本研究旨在建立鉴别兔出血症病毒经典毒株(RHDV)和变异毒株(RHDV2)的RT-PCR检测方法。根据Gen Bank中经典RHDV和RHDV2的VP60基因序列,设计2对分别结合两种基因的特异性引物。利用2对引物,以人工合成RHDV2的VP60基因构建的p MD19-T-VP60-2和p MD19-T-VP60为模板,进行RT-PCR体系退火温度的优化,优化后的退火温度为58.2℃。对优化后的RT-PCR体系进行RHDV和RHDV2的敏感性试验、特异性试验,并用于检测RHDV人工感染样品和疑似临床样品,结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,经典RHDV和RHDV2的检测限度分别为95拷贝和76拷贝的靶基因片段,且对支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌等病原以及重组质粒p MD19-T-EBHSV的检测结果均为阴性。RHDV人工感染的组织样品检出率为100%,15份临床样品中3份为经典RHDV阳性,其他均为经典RHDV及RHDV2阴性。该方法的建立能够实现快速、特异及敏感地检测RHDV和RHDV2,为监测RHDV变异株的流行情况提供技术支撑。

兔出血症病毒2型的VP60基因保守区人工合成及RT-PCR检测方法初探

为建立用于兔出血症病毒2型(RHDV2)的快速检测方法,根据Gen Bank已公布的RHDV和RHDV2VP60基因,设计合成2对特异性引物和10条末端重叠引物,通过重叠PCR人工合成RHDV2 VP60基因中保守区片段,构建重组质粒,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和35份样品检测应用,初步建立RHDV2 RT-PCR检测方法。实验成功合成RHDV2 VP60基因的435 bp保守片段并构建了p MD-19T-RHDV2重组质粒,初步建立的RHDV2 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,RHDV2的检测限度可达到230个拷贝的靶基因片段,检测RHDV、p GM-T-EBHSV(已构建)、兔巴氏杆菌、兔源大肠埃希菌和沙门氏菌均无特异性扩增,样品检测结果显示样品中RHDV2核酸阴性。该研究为中国及时进行RHDV2的防控提供技术储备。

四川省兔出血症病毒2型流行病学调查及遗传变异分析

为了解四川省兔出血症病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus type 2,RHDV2)的流行情况及分子遗传变异特征,采集全省范围内的7525份样品,其中发病兔场肝脏组织样品117份、环境拭子样品243份,受监测兔场血液样品3340份、环境拭子样品3825份,采用商品化荧光RT-PCR试剂盒,对以上样品进行RHDV2检测;对筛选出的12份肝组织阳性样品进行RHDV2 VP60基因RT-PCR扩增、测序和遗传进化分析。结果显示:RHDV2流行无明显季节性,各养殖品系家兔均有RHDV2感染,哺乳仔兔、幼兔、怀孕哺乳母兔死亡率分别为25%~60%、18%~45%、9%~30%。发病兔场肝脏样品RHDV2阳性检出率为88.89%(104/117),环境样品为46.09%(112/243);受监测兔场全血样品RHDV2阳性检出率为25.99%(868/3340),环境样品为16.29%(623/3825)。12份阳性样品的RHDV2 VP60基因序列长度均为1740 bp,核苷酸序列同源性为98.4%~100%,在系统发生进化树上独成一簇;与国内外参照毒株的VP60基因序列核苷酸同源性为93.7%~100%,编码的氨基酸序列同源性为95.7%~99.8%。结果表明:RHDV2已开始在四川省流行,需要加强检疫,重视饲养管理工作;其VP60基因序列出现了一定程度的变异,但遗传演化相对稳定。本研究补充了国内RHDV2的分子流行病学信息,也为该病的相关防控研究和控制对策制定提供了参考。

兔出血症病毒2型检测技术的研究进展

本文针对近年来国内外兔出血症病毒2型(RHDV2)检测方法和诊断技术的研究进展进行综述,旨在为RHDV2的早诊、监测和预防提供技术参考。

一株兔出血症病毒2型鉴定与vp60基因序列分析

兔病毒性出血症2型是由兔病毒属兔出血症病毒2型(RHDV2)引起的一种剧烈性、高度致死性兔传染病,主要病变为以实质器官出血。2010年该病在法国首次被发现,主要在欧洲流行,病兔死亡率高达80%以上。2020年4月,四川金堂县某兔场发生急性死亡病例,死亡率高达56.3%,初步怀疑为RHDV2感染。实验室对采集病料进行RT-PCR扩增、基因序列分析和病毒复制试验,结果显示其vp60基因核苷酸序列与经典RHDV的vp60基因核苷酸序列一致性为77.85%~80.94%,与RHDV2的vp60基因核苷酸序列的一致性为93.81%~97.77%,与RHDV2位于同一个进化分支。病毒复制试验显示,用病死家兔内脏组织悬液人工感染2月龄家兔(已免疫RHDV vp60株灭活苗),5只家兔在24~36 h内全部死亡,提取其内脏混合物RNA进行RT-PCR扩增并测序,结果显示其与发病兔场分离毒株一致。鉴定本次分离得到的毒株为RHDV2,并将其命名为CD202004,该毒株的发现为RHDV2检测试剂的研发和疫苗的研制提供基础。

1例兔出血症病毒2型感染疫情的诊断

旨在了解河南疑似兔出血症病毒2型(RHDV2)的感染情况,并对RHDV2的致病性进行初步分析。本研究采集病死兔的肝组织,利用微量血凝试验、RT-PCR扩增及测序、VP60基因系统进化树分析和动物回归试验进行病原鉴定。微量血凝试验结果显示,组织样本悬液能够凝集人“O”型血红细胞;RT-PCR扩增、测序及序列分析结果显示,检测到RHDV2特异性条带,片段大小为829 bp;系统进化树分析结果发现,分离的病毒与我国四川发现的首例RHDV2毒株SC2020/04的VP60基因相似性高达98.2%;临床病例的剖检显示病死兔胸腺、气管、肺、肝、脾、肾等实质性器官出血较为严重;动物回归试验发现攻毒组家兔死亡率为100%,平均死亡时间为65.8 h,RT-PCR扩增均检测到RHDV2特异性条带。本研究首次在河南兔场检测到RHDV2,为RHDV2的防控提供了科学参考。

兔病毒性出血症二价口服疫苗免疫抗体水平测定

为验证兔病毒性出血症二价口服疫苗(AN301,R301-1)饮水免疫的免疫效果,分别选择母兔和商品兔进行了饮水免疫1次,取免疫后7、14、21、28、42 d等时间点采集血清样品,并按照一定浓度梯度稀释后分别采用间接ELISA和阻断ELISA进行了RHDV1和RHDV2的抗体水平检测。结果显示,受试母兔免疫后14、28 d、产仔后7和14 d期间RHDV1和RHDV2抗体效价都在1∶1000~1∶8000之间,抗体水平增加并趋于稳定;商品兔免疫7、14、28、42 d期间RHDV1和RHDV2抗体水平都在1∶1000~1∶8000之间,抗体水平增加并趋于稳定。说明兔病毒性出血症二价口服疫苗(AN301,R301-1)饮水免疫后可刺激母兔和商品兔产生相对稳定的RHDV1和RHDV2的抗体水平,为该疫苗的进一步推广应用提供了科学参考。

兔出血症病毒与兔出血症病毒2型复合RT-PCR检测方法的初步研究

为建立用于兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)鉴别诊断的检测方法。根据Gen Bank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因,设计合成6对特异性引物和10条搭桥引物,采用RT-PCR和搭桥PCR技术分别获取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守区片段,构建重组质粒p MD-19T-RHDV2、p MD-19T-RHDV441和p MD-19T-RHDV294,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及人工感染RHDV样品和临床样品的应用,对RHDV与RHDV2的复合RT-PCR检测方法进行了初步研究。结果显示,建立的RHDV与RHDV2复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和RHDV2的VP60保守区基因片段大小为294 bp和435 bp,RHDV与RHDV2的检测限度分别为160和230个拷贝的靶基因片段,而p GM-T-EBHSV(已构建)、兔巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和沙门菌等病原的检测结果均为阴性。样品检测结果显示,人工感染样品的RHDV检出率为100%(5/5),30份临床检样RHDV和RHDV2检测结果均为阴性。

兔出血症病毒2型感染的病例诊断

为了解河南疑似兔出血症病毒2型(RHDV)的感染情况,并对RHDV的致病性进行初步分析。研究采集病死兔的肝组织,利用微量血凝试验、RT-PCR扩增及测序、VP60基因系统进化树分析和动物回归试验进行病原鉴定。微量血凝试验结果显示,组织样本悬液能够凝集人“O”型血红细胞;RT-PCR扩增、测序及序列分析结果显示,检测到RHDV特异性条带,片段大小为829 bp;系统进化树分析结果发现,分离的病毒与我国四川发现的首例RHDV毒株SC2020/04的VP60基因相似性高达98.2%;临床病例的剖检显示病死兔胸腺、气管、肺、肝、脾、肾等实质性器官出血较为严重;动物回归试验发现攻毒组家兔病死率为100%,平均死亡时间为65.8 h,RT-PCR扩展均检测到RHDV特异性条带。该研究是首次在河南兔场检测到RHDV,为RHDV的防控提供科学参考。