酿酒酵母rho1活性突变细胞株的构建

酿酒酵母CWI信号途径中,包含了一个与细胞表面感受器配对的小G蛋白家族,叫做RHO1.作者采用定点突变的方法,构建了rho1活性突变细胞株,为进一步研究Rho1功能奠定了基础.

长片段融合PCR在构建烟曲霉rho1基因回补株中的应用

目的融合PCR是一种常用的构建重组片段或重组质粒的手段,但长片段融合PCR的难度较大。文中将探讨长片段融合PCR过程中引物设计及扩增条件对产物的影响。方法以构建烟曲霉rho 1基因回补株为例,采用融合PCR的方法扩增重组片段(长达6.5 kb),在引物设计时引入不同大小的同源区,并设置不同的扩增体系。结果当设计引物的同源区为35 bp,选用具有高扩增效率、高保真性的DNA聚合酶,以及各片段在融合PCR反应体系中的浓度为15 ng/μL时,实现了长达6.5 kb的片段扩增并完成了烟曲霉rho 1回补株的构建。结论在合适的PCR引物设计、片段浓度配比及聚合酶条件下,长片段融合PCR在丝状真菌的基因敲除及回补株的构建中是一种非常有效的工具。

磁共振T1rho序列、T2 mapping技术在膝关节早期软骨退变早期诊断中的评估价值

目的探讨磁共振T1rho序列、T2 mapping技术在膝关节早期软骨退变早期诊断中的评估价值。方法选取2020年1月至2022年11月在我院治疗的110例膝关节早期软骨退变患者(观察组),按照疾病严重程度分为轻度退变组及重度退变组,另选取同期在我院进行体检的64例健康者为对照组,受试者均行磁共振T1rho序列、T2 mapping技术扫描,测量受试者T2值及T1ρ值,探讨磁共振T1rho序列、T2 mapping技术在膝关节早期软骨退变早期诊断中的评估价值。结果观察组股骨外侧面、股骨内侧面、胫骨外侧面、胫骨内侧面、髋骨面T2值均明显高于对照组(P<0.05),重度退变亚组患者股骨外侧面、股骨内侧面、胫骨外侧面、胫骨内侧面、髋骨面T2值显著高于轻度退变者(P<0.05);观察组股骨内踝负重区、股骨内踝非负重区、股骨外踝负重区、股骨外踝非负重区、胫骨外侧平台区、胫骨内侧平台区、髌后软骨区磁共振T1ρ值明显高于对照组(P<0.05),重度退变亚组患者股骨内踝负重区、股骨内踝非负重区、股骨外踝负重区、股骨外踝非负重区、胫骨外侧平台区、胫骨内侧平台区、髌后软骨区磁共振T1ρ值明显高于轻度退变亚组患者(P<0.05);磁共振T1rho序列在膝关节早期软骨退变中早期诊断及严重程度评估中的的诊断ROC值及特异度明显高于T2 mapping技术(P<0.05),但后者具有更高的敏感度(P<0.05)。结论磁共振T1rho序列、T2 mapping技术均能有效反映膝关节早期软骨退变中软骨组织学成分变化情况,还可为膝关节软骨退变严重程度评估提供客观依据,二者具有一定互补价值。

Rho A-Rock 1信号通路对传染性脾肾坏死病毒感染的调控及作用

【目的】探究传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)复制增殖与Rho A-Rock 1通路的关系。【方法】采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ISKNV感染CPB细胞12,24,48,72和96 h后病毒DNA拷贝数的变化;同时采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹方法检测病毒感染CPB细胞12,24,48和72 h后Rho A与Rock 1转录及蛋白表达水平的变化;通过Rho A抑制剂(CCG-1423和Rhosin)、Rock 1抑制剂(Thiazovivin和Y-27632)及siRNA抑制Rho A-Rock 1通路,研究Rho A-Rock 1通路抑制对ISKNV复制增殖的影响。【结果】ISKNV感染12~48 h,病毒的DNA拷贝数无显著变化,感染72 h病毒DNA拷贝数显著上升,感染96 h病毒的拷贝数上升变缓,说明ISKNV感染72 h时病毒正处于复制增殖的高峰期。RT-qPCR及蛋白免疫印迹结果表明,ISKNV感染72 h时,Rho A和Rock 1 mRNA转录水平和蛋白水平均显著上调。Rho A抑制剂Rhosin和CCG-1423及Rock 1抑制剂Y-27632和Thiazovivin均可使ISKNV基因组拷贝数和病变的CPB细胞数显著下调;利用siRNA敲降Rho A和Rock 1时,ISKNV的基因组拷贝数也显著下调。【结论】Rho A-Rock 1信号通路可正调控ISKNV的感染,抑制Rho A-Rock 1通路可显著抑制ISKNV复制增殖。

右美托咪定减轻呼吸机相关性肺损伤模型大鼠肺组织损伤

目的探讨右美托咪定(DEX)对呼吸机相关性肺损伤(VILI)大鼠肺组织Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho激酶1(ROCK1)信号通路的影响。方法建立VILI大鼠模型,将大鼠分为对照组(control组)、模型组(VILI组)、右美托咪定低、高剂量组(DEX-L、DEX-H组)、右美托咪定高剂量+溶血磷脂酸(LPA)组(DEX-H+LPA组)。测定大鼠肺组织湿/干质量比值(W/D);HE染色观察肺组织病理形态;ELISA试剂盒检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的水平;TUNEL染色法检测肺上皮细胞死亡;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白及RhoA、ROCK1表达水平。结果DEX可以减轻VILI大鼠肺损伤,降低肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达(P<0.05),升高Bcl-2表达(P<0.05);LPA可以促使大鼠肺损伤加重,肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达升高(P<0.05),Bcl-2表达降低(P<0.05)。结论右美托咪定可能通过抑制RhoA/ROCK1通路保护大鼠呼吸机相关性肺损伤。

生物钟基因BMAL1通过促进ROCK1调控滋养层细胞功能障碍的研究

目的 分析生物钟基因脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白类似蛋白1(BMAL1)对Ras同源物基因组成员A(RhoA)/Rho相关激酶1(ROCK1)信号通路的影响以及对滋养层细胞生物学功能的调控机制。方法 选择滋养层细胞系JEG3细胞,根据转染BMAL1过表达质粒以及添加1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L ROCK1抑制剂Y27632,分为对照组、BMAL1组、BMAL1+1μmol/L Y27632组、BMAL1+2μmol/L Y27632组、BMAL1+5μmol/L Y27632组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BMAL1、RhoA、ROCK1以及上皮-间充质转化(EMT)标记物N-cadherin、Vimentin和转录因子Snail、Slug的mRNA表达水平;Western blot检测蛋白表达水平;CCK8法检测细胞的增殖活力;流式细胞术分别检测细胞周期、凋亡以及胞内活性氧(ROS)水平。结果 JEG3细胞过表达BMAL1后,与对照组相比,ROCK1 mRNA表达显著增加(P<0.01),RhoA mRNA表达增加但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,BMAL1组N-cadherin、Vimentin、Snail的mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。在蛋白水平,BMAL1组ROCK1、RhoA及Snail蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05),Y27632处理可以显著降低Vimentin及Snail蛋白表达(P<0.05)。此外,与对照组相比,BMAL1组细胞活力显著增加(P<0.001),BMAL1+Y27632各浓度组较BMAL1组细胞活力显著降低(P<0.01)。流式细胞术结果显示,与对照组相比,BMAL1组细胞周期由G0/G1期向S+G2/M期转化,细胞总凋亡率有降低趋势但差异无统计学意义(P>0.05),胞内ROS水平显著降低(P<0.01);与BMAL1组相比,BMAL1+1μmol/L Y27632组和BMAL1+2μmol/L Y27632组细胞早期凋亡率及总凋亡率显著增加(P<0.05),BMAL1+1μmol/L Y27632组细胞ROS平均荧光强度增加但差异无统计学意义(P>0.05),BMAL1+2μmol/L Y27632组细胞ROS平均荧光强度较BMAL1组显著增加(P<0.001)。结论 生物钟基因BMAL1通过促进ROCK1表达参与调控滋养层细胞增殖、DNA合成、凋亡及氧化应激水平。

麦冬皂苷B调节Rho A/ROCK1信号通路对胃荷瘤大鼠肿瘤生长的抑制作用

目的 探讨麦冬皂苷B(ophiopogonin B,OP-B)对胃荷瘤大鼠肿瘤生长的影响及其作用机制。方法 将66只体质量为180~200 g的6周龄SPF级SD大鼠(雌雄各半)按随机数字表法分为模型组,OP-B低、中、高剂量组,激活剂组,每组10只。采用原位移植Walker-256肿瘤组织建立胃荷瘤模型,OP-B低、中、高剂量组大鼠分别灌胃17.5、35、70 mg/kg的OP-B并腹腔注射等量生理盐水,激活剂组灌胃70 mg/kg的OP-B并腹腔注射1 mg/kg的Rho A/ROCK1信号通路激活剂溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA),模型组灌胃和腹腔注射等量的生理盐水;记录移植瘤质量及体积,计算抑瘤率;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察肿瘤组织形态;原位末端转移酶标记技术(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL)染色检测肿瘤组织细胞凋亡;免疫组织化学染色检测肿瘤组织细胞核增殖抗原67(proliferating cell nuclear antigen, Ki-67)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Cleaved Caspase-3)表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测Ras同源基因家族蛋白A(Ras homologous gene family member A,Rho A)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase1,ROCK1)的表达;Western blot检测Rho A、ROCK1蛋白表达。结果 与模型组比较,OP-B低、中、高剂量组肿瘤质量和体积、Ki-67阳性率及Rho A、ROCK1 mRNA和蛋白表达显著降低,抑瘤率、肿瘤细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3阳性率显著升高(P<0.05);与OP-B高剂量组比较,激活剂组肿瘤质量和体积、Ki-67阳性率及Rho A、ROCK1 mRNA和蛋白表达显著升高,抑瘤率、肿瘤细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3阳性率显著降低(P<0.05)。结论 OP-B可能通过抑制Rho A/ROCK1信号通路的激活,抑制胃荷瘤大鼠肿瘤生长。

Rho-GTPases基因对烟曲霉和构巢曲霉细胞壁、菌丝形态、应激反应及毒力的影响

曲霉是广泛存在于自然界中的条件致病真菌,可导致侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA),常见的致病菌有烟曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉等。近些年来IA的发生率呈上升趋势,同时全球高达20%的曲霉分离株对常用的抗真菌药物表现出耐药性。Rho-GTPases家族基因以rho1、cdc42和rac1的研究最为广泛,它作为“分子开关”调节真菌形态发生与侵袭力。该文主要综述了rho1、cdc42和rac1对烟曲霉和构巢曲霉细胞壁合成、菌丝形态建立、应激反应及毒力的影响,有助于厘清曲霉极性生长和致病性方面的分子机制,为抗真菌药物的研发提供新思路。

DEC2通过阻断TGF-β/ROCK1信号通路抑制小鼠肾小球内皮细胞转分化和肾纤维化

目的 基于分化型胚胎软骨发育基因2(DEC2)通过转化生长因子β/Rho相关激酶1(TGF-β/ROCK1)信号通路探讨对肾小球内皮细胞转分化的保护机制。方法 将小鼠随机分为假手术组、单侧输尿管梗阻(UUO)组、空载体处理的UUO组和过表达DEC2的UUO组,每组6只。除假手术组外,其余组建立UUO模型。空载体处理的UUO组和过表达DEC2的UUO组,于第0天(UUO后立即)在超声系统的引导下每侧肾脏注射10μL(108个嗜菌斑形成单位[PFU])空载体或DEC2载体。术后14 d处死小鼠,HE染色检测肾组织学病变情况、 Masson染色检测肾纤维化情况,Western blot法检测肾组织DEC2、 α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、 Rho相关激酶1(ROCK1)的蛋白表达。正常人肾小球内皮细胞(GEnC),采用ROCK1抑制剂Y-27632处理或转染DEC2, Western blot法检测暴露于TGF-β的GEnC中ROCK1、 α-SMA、 DEC2、 E-cadherin表达影响。通过免疫荧光细胞化学染色检测GEnC中ROCK1和DEC2定位,并通过免疫共沉淀实验验证二者的相互作用关系。结果 与假手术组相比,UUO组在第14天出现显著的肾纤维化和胶原蛋白积聚。在UUO组中,小鼠肾组织中DEC2和E-cadherin的表达显著降低,α-SMA的表达显著增加。与空载体处理的UUO组相比,过表达DEC2的UUO组小鼠肾纤维化和胶原蛋白积聚程度降低,并且小鼠肾组织中ROCK1、 α-SMA表达降低和DEC2、 E-cadherin表达增加。TGF-β以时间依赖性方式增强GEnC中ROCK1和α-SMA表达,并且DEC2、 E-cadherin水平降低。用ROCK1抑制剂Y-27632处理可部分消除TGF-β诱导的ROCK1、 α-SMA表达增加和DEC2、 E-cadherin表达降低。此外,在TGF-β刺激前,将GEnC转染DEC2降低细胞中ROCK1、 α-SMA表达,并增加DEC2、 E-cadherin表达。免疫荧光染色显示DEC2在GEnC中与ROCK1共定位,并且免疫共沉淀结果显示DEC2与ROCK1相互拉低。结论 DEC2在纤维化肾组织中下调,上调DEC2通过阻断TGF-β/ROCK1信号通路抑制GEnC的上皮肌纤维母细胞转分化及肾纤维化。

COPD合并肺动脉高压患者血清ROCK1、AgRP水平及临床意义

目的分析慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并肺动脉高压(PH)患者血清Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)、刺鼠相关神经肽(AgRP)水平及临床意义。方法选取2020年1月—2022年7月新疆医科大学第五附属医院呼吸与危重症科收治的COPD患者150例为COPD组,根据是否合并PH分为PH亚组39例和非PH亚组111例;另选取同期体检健康志愿者60例为健康对照组。检测受试人员血清ROCK1、AgRP、炎性因子[白介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平和肺功能[第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV_(1)%)、第1秒用力呼气容积/用力肺活量比值(FEV_(1)/FVC)]。采用Pearson/Spearman相关性分析COPD合并PH患者血清ROCK1、AgRP与肺功能指标和炎性因子的相关性,采用多因素Logistic回归分析COPD合并PH的影响因素,采用受试者工作特征曲线分析血清ROCK1、AgRP水平对COPD合并PH的评估价值。结果与健康对照组比较,COPD组血清ROCK1、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平升高,AgRP水平和FEV_(1)%、FEV_(1)/FVC降低(t=26.657、26.350、15.690、12.567、15.987、17.235、27.639、26.348,P均<0.001)。与非PH亚组比较,PH亚组血清ROCK1、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平升高,AgRP水平和FEV_(1)%、FEV_(1)/FVC降低(t=5.858、4.503、5.045、4.455、4.472、6.048、4.207、5.206,P均<0.001)。COPD合并PH患者血清ROCK1与FEV_(1)%、FEV_(1)/FVC呈负相关,与IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α呈正相关(r=-0.647、-0.689、0.672、0.656、0.710、0.624,P均<0.001);AgRP与FEV_(1)%、FEV_(1)/FVC呈正相关,与IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α呈负相关(r=0.627、0.705、-0.607、-0.601、-0.661、-0.610,P均<0.001)。FEV_(1)%高、FEV_(1)/FVC高、AgRP高为COPD患者合并PH的独立保护因素[OR(95%CI)=0.877(0.770~0.999)、0.820(0.710~0.946)、0.552(0.359~0.850)],IL-1β高、IL-6高、IL-8高、TNF-α高、ROCK1高为独立危险因素[OR(95%CI)=1.156(1.025~1.303)、2.011(1.160~3.485)、1.161(1.032~1.307)、1.107(1.025~1.197)、1.487(1.102~1.875)]。血清ROCK1、AgRP水平及二项联合预测COPD合并PH的曲线下面积分别为0.777、0.769、0.853,二项联合的AUC高于单项预测(Z/P=2.410/10.016、2.598/0.009)。结论COPD合并PH患者血清ROCK1水平降低和AgRP水平升高,与肺功能下降和炎性反应有关,ROCK1联合AgRP评估COPD合并PH的价值较高,可能成为其辅助诊断指标。

2种Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶对经皮冠状动脉介入治疗无复流的预测价值

目的探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)1和ROCK2对急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者经皮冠状动脉介入治疗(PCI)无复流的预测价值。方法选取168例接受PCI的STEMI患者作为研究对象,根据是否发生无复流分为无复流组和血流正常组,并分别根据ROCK1、ROCK2表达情况分为高表达组和低表达组。使用酶联免疫吸附试剂盒检测患者血清ROCK1、ROCK2水平,分析无复流组与血流正常组的血清ROCK1、ROCK2水平差异,分析STEMI患者PCI无复流的危险因素,并分析ROCK1、ROCK2对STEMI患者PCI无复流的预测价值。结果168例STEMI患者中,46例发生无复流,发生率为27.38%。无复流组的Killip分级、发病至入院时间、未使用预防性无复流药物者占比、血清ROCK1水平、血清ROCK2水平高于或长于血流正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。ROCK1高表达组的无复流发生率高于ROCK1低表达组,ROCK2高表达组的无复流发生率高于ROCK2低表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logsitic回归分析显示,Killip分级为Ⅲ~Ⅳ级、发病至入院时间较长、未使用预防性无复流药物、血清ROCK1水平较高、血清ROCK2水平较高均为STEMI患者PCI无复流的独立危险因素(P<0.05)。受试者工作特征曲线显示,ROCK1、ROCK2对STEMI患者PCI无复流的预测价值较高,且两者联用后预测价值提升,曲线下面积为0.789(95%CI:0.711~0.867)。结论血清ROCK1、ROCK2水平较高是STEMI患者PCI无复流的危险因素,两者联合检测对PCI无复流具有较高的预测价值。

磁共振T1ρ在大鼠肝纤维化模型中的应用价值

目的研究磁共振T1ρ在肝纤维化进程中的变化特征,探讨T1ρ在肝纤维化大鼠模型中的应用价值。方法 SD大鼠65只(对照组15只,模型组50只),模型组采用四氯化碳诱导不同时间以获取不同程度的肝纤维化。使用3.0T磁共振应用5个自旋锁定时间获得T1ρ值。扫描后行肝脏病理学检查,将影像结果与病理结果行对照分析。结果 5只大鼠在造模过程中死亡,60只大鼠纳入分析,肝纤维化各期的T1ρ值在5组间整体比较差异有统计学意义(P<0.05)。单因素方差分析,T1ρ值在F1期和F2期之间没有差异,在其余各期之间均有统计学差异。相关性分析结果为T1ρ值与肝纤维化程度呈正相关(r=0.863,P<0.05)。结论磁共振T1ρ可以作为一种无创、敏感的新技术用于探测肝肝纤维进程中病理及生理改变,有助于早期检测和定量诊断肝纤维化。

枸杞多糖对高糖所致RF/6As通透性和Rho激酶的影响

目的探讨高糖条件下猴脉络膜-视网膜内皮细胞(RF/6As)损伤时的单层通透性、Rho激酶1(ROCK1)的变化及它们之间的关系,和枸杞多糖(LBP)对上述变化的影响。方法体外培养RF/6As,分为等渗葡萄糖处理组(对照组)、40mmol/L葡萄糖处理组(高糖组)及LBP+40mmol/L葡萄糖处理组(LBP+高糖组)。各组分别培养1、3、5、7d,应用倒置显微镜观察培养的RF/6As形态,以辣根过氧化物酶(HRP)作为示踪剂用二室弥散系统检测RF/6As单层通透性的变化,应用免疫荧光法观察各组不同时间点细胞骨架的变化,采用Westernblot法检测ROCK1在5d、7d各组细胞中的表达量。结果第3、5、7天,高糖组RF/6As随时间延长逐渐变形,正常细胞数量明显减少,单层通透性逐渐增加;3个时间点HRP的A值分别为0.074±0.011、0.135±0.022、0.253±0.047,明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。LBP+高糖组仅于7d时细胞形态略有改变,5d及7d时HRP的A值分别为0.069±0.004和0.114±0.009,较对照组明显增加,差异均有统计学意义(P<0.01);但明显低于高糖组,差异均有统计学意义(P<0.01)。Westernblot检测显示,7d时LBP+高糖组ROCK1灰度值为35849.47±1032.36,高糖组为21356.10±1566.66,差异有统计学意义(P<0.01)。结论高糖可引起RF/6As单层通透性增加和细胞骨架的重排以及ROCK1的高表达,而LBP可通过下调ROCK1的表达减轻高糖对RF/6As的损伤。

体外沉默ICMT基因对人唾液腺腺样囊性癌细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶(isoprene cysteine carboxymethyl transferase,ICMT)基因对唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)细胞迁移和侵袭的影响及相关机制,为SACC的分子靶向治疗提供实验依据。方法 体外培养腺样囊性癌细胞SACC-LM和SACC-83,采用脂质体载体瞬时转染的方法,将ICMT siRNA转染至人SACC-LM和SACC-83细胞中(实验组),并分别设置空白对照组和阴性对照组(转染NC-siRNA)。通过qRT-PCR检测转染后各组细胞中ICMT和RhoA的m RNA表达并明确沉默效率;Western blot检测各组的ICMT、膜RhoA、总RhoA、Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1(Rho associations contain curly helical binding protein kinase 1,ROCK1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达;通过CCK-8实验检测SACC细胞的增殖能力;通过比较细胞划痕实验的相对愈合面积和Transwell实验细胞穿膜数目,分别检测SACC细胞的迁移和侵袭能力。结果 SACC-LM和SACC-83细胞转染ICMT-siRNA后,实验组相较于空白对照组和阴性对照组,ICMT mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05),但RhoA mRNA和RhoA总蛋白表达均无显著性差异(P>0.05);膜RhoA、ROCK1、MMP-2、MMP-9的蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞增殖能力明显下降(P<0.05),迁移和侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论 体外沉默ICMT基因可有效抑制人SACC-LM和SACC-83细胞迁移及侵袭能力,其机制可能与RhoA-ROCK信号通路有关。

肝脏T1rho MRI扫描优化及对肝纤维化的诊断价值初探

目的:探讨3.0T肝脏T1rho MRI最简自旋锁定时间(SLT)扫描方案及用于诊断肝纤维化的可行性。方法:前瞻性搜集20例正常志愿者(正常组)和20例慢性肝病且临床疑诊为肝纤维化者(肝纤维化组),均行肝脏T1rho MRI扫描。自旋锁定脉冲设定为500Hz,SLT为1、10、20、30、40和50ms。扫描结束后分别采用所有6-SLT(1、10、20、30、40和50ms)和5种简化SLT组合,即最大SLT为40ms的5-SLT(1、10、20、30、和40ms)、最大SLT为50ms的3-SLT(1、10、50ms;1、20、50ms;1、30、50ms;1、40、50ms),生成T1rho mapping。通过兴趣区(ROI)放置法测量各组合肝脏的T1rho值。采用配对样本t检验比较各简化SLT组合与6-SLT所测肝脏T1rho值的差异;采用Bland-Altman法分析各简化SLT组合与6-SLT所测肝脏T1rho值的一致性。采用ROC曲线分析6-SLT与简化SLT组合对肝纤维化诊断效能的差异。结果:正常组、肝纤维化组6-SLT和5种简化SLT组合所测肝脏T1rho值分别为(44.86±2.65)ms vs(53.01±5.79)ms、(43.07±3.15)ms vs(50.90±5.62)ms、(45.24±2.62)ms vs(53.22±5.25)ms、(45.11±2.53)ms vs(53.85±5.13)ms、(45.11±2.60)ms vs(52.80±5.53)ms和(45.22±2.64)ms vs(53.68±5.78)ms,两组间的差异均有统计学意义(P值均<0.001),用于诊断肝纤维化的曲线下面积(AUC)分别为0.910、0.895、0.910、0.933、0.917和0.923;5种简化SLT组合与6-SLT相比,诊断效能差异均无统计学意义(P值均>0.05)。其中正常组和肝纤维化组最大SLT为50ms的3-SLT所测肝脏T1rho值与6-SLT差异均无统计学意义(P>0.05),最大SLT为40ms的5-SLT所测肝脏T1rho值与6-SLT差异有统计学意义(P<0.01)。Bland-Altman分析结果显示所有3-SLT组合与6-SLT差值的散点分布在正常组和肝纤维化组中均较集中,且3-SLT(1、10、50ms)组合的差值和95%一致性区间最小,分别为-0.37(-2.12～1.37)、-0.2(-3.7-3.3)。结论:3-SLT和5-SLT均能简化6-SLT(1～50ms)以测量肝脏T1rho值,可用于诊断肝纤维化,且最大SLT为50ms的3-SLT测量的肝脏T1rho值与6-SLT(1～50ms)差异无统计学意义,其中3-SLT(1、10、50ms)组合的测量变异度最小。

miR-335及ROCK1在骨肉瘤中表达及相互关系研究

目的探讨miR-335及rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)在骨肉瘤组织及细胞系中表达的情况及两者的相关性。方法临床选取18例骨肉瘤组织标本及配对正常骨骼肌组织标本;设定人正常成骨细胞为对照组,骨肉瘤细胞系MG-63和U2-OS为实验组,RT-PCR检测骨肉瘤组织与各组细胞中miR-335与ROCK1 mRNA的表达差异;miR-335 mimic转染MG-63和U2-OS两细胞系,检测miR-335过表达对ROCK1mRNA和蛋白表达的影响。结果 miR-335在骨肉瘤组织及细胞系中特异性低表达,而ROCK1则呈高表达,两者呈负相关;转染miR-335mimic后,miR-335mRNA过表达,ROCK1mRNA和蛋白表达在MG-63和U2-OS两细胞系中受到显著抑制。结论 miR-335与ROCK1表达在骨肉瘤组织学水平和细胞学水平均成负相关;过表达miR-335可降低ROCK1的表达。

沙蟾毒精激活Rho A/ROCK1信号通路诱导急性白血病细胞凋亡的分子机制研究

目的研究沙蟾毒精(arenobufagin,ARE)对急性白血病细胞的凋亡诱导作用及可能的分子机制。方法急性白血病细胞Jurkat和MV-4-11经不同浓度(0、10、20、40、80 nmol/L)ARE作用24 h,80 nmol/L ARE作用不同时间(0、6、12、18、24 h)或ROCK1抑制剂Y-27632(20μmon/L)预处理1 h后80 nmol/L ARE作用24 h,采用MTT检测ARE抑制急性白血病细胞增殖的能力;采用流式细胞术检测ARE诱导急性白血病细胞凋亡的能力;采用Western blot和CoIP实验检测急性白血病细胞经ARE作用后细胞中凋亡相关蛋白和Rho A/ROCK1信号通路相关蛋白的变化情况。结果ARE对Jurkat和MV-4-11细胞的抑制增殖作用呈剂量依赖性和时间依赖性(P<0.01),对Jurkat和MV-4-11细胞凋亡诱导作用亦呈剂量和时间依赖性(P<0.01);Western blot检测结果显示:ARE可激活ROCK1信号通路,促进BAX移位至线粒体,Cytochrome c(Cyto c)和AIF由线粒体释放入细胞质,增加Caspase 3和Caspase 7剪切激活,增加PARP1剪切,并减少XIAP表达,其上述作用具有剂量依赖性和时间依赖性(P<0.01);使用Y-27632抑制ROCK1信号通路可明显阻断ARE诱导的BAX移位至线粒体、Cyto c和AIF向细胞质的释放、Caspase 3和Caspase 7的剪切激活、PARP1的剪切、XIAP表达的下调以及细胞凋亡(P<0.01)。结论ARE通过激活Rho A/ROCK1信号通路有效诱导急性白血病细胞(Jurkat、MV-4-11)发生凋亡。

Rho激酶-1在变应性鼻炎小鼠上下呼吸道表达特点及布地奈德的干预作用

目的观察Rho激酶-1在变应性鼻炎上下呼吸道表达特点及布地奈德对其表达影响,探讨Rho激酶-1在变应性鼻炎上下呼吸道炎症反应中的作用。方法应用卵清蛋白致敏建立小鼠变应性鼻炎模型,30只小鼠随机分为:变应性鼻炎组,布地奈德组和正常对照组。所有小鼠于末次激发后24小时处死,收集鼻腔灌洗液和肺泡灌洗液查炎症细胞计数,应用免疫组化方法检测鼻黏膜和肺组织中Rho激酶-1蛋白表达。结果变应性鼻炎组鼻黏膜和肺组织内Rho激酶-1蛋白阳性表达水平显著高于正常对照组(P<0.05)。变应性鼻炎组小鼠鼻腔灌洗液和肺泡灌洗液中以炎症细胞总数和嗜酸粒细胞增加明显(P<0.05)。应用布地奈德干预治疗后,小鼠鼻黏膜和肺组织内Rho激酶-1蛋白阳性表达较变应性鼻炎组水平降低,小鼠鼻腔灌洗液和肺泡灌洗液中以炎症细胞总数和嗜酸粒细胞数较变应性鼻炎组减少。Rho激酶-1蛋白表达与炎症细胞和嗜酸粒细胞数呈正相关(P<0.01)。结论 Rho激酶-1蛋白参与变应性鼻炎上下呼吸道炎症反应过程,布地奈德可通过调节Rho激酶-1的表达减轻炎症反应。

盐酸法舒地尔通过活化Akt与抑制PTEN减轻顺铂导致的肾小管上皮细胞凋亡

目的:探讨盐酸法舒地尔(fasudil)能否通过活化Akt并抑制PTEN减轻顺铂(CP)导致的肾小管上皮细胞凋亡。方法:健康雄性SD大鼠随机分为3组(每组12只),包括正常对照(control)组、CP组及CP+fasudil组。生理盐水或顺铂腹腔注射96 h后处死SD大鼠,留取血液和肾脏组织,检测血尿素氮(BUN)、血清肌酐(s Cr)水平。PAS染色光镜观察肾脏形态结构的变化;TUNEL染色检测肾小管上皮细胞凋亡;分别采用Western blotting法和/或免疫组化技术检测Rho蛋白激酶1(ROCK1)、PTEN、Akt蛋白表达变化及磷酸化Akt(p-Akt)水平。结果:与control组比较,CP组与CP+fasudil组大鼠的BUN及s Cr水平、凋亡细胞阳性率、ROCK1及PTEN蛋白表达均显著升高(P<0.05),而p-Akt表达则显著减少(P<0.05);PAS染色光镜示CP组肾脏组织结构出现明显损伤性变化;与CP组比较,CP+fasudil组的s Cr水平、凋亡细胞阳性率、ROCK1及PTEN蛋白表达均显著下调(P<0.05),而p-Akt水平则显著增高(P<0.05);此外,肾脏病理损伤减轻。结论:盐酸法舒地尔可以减轻顺铂引起肾小管上皮细胞凋亡,其机制可能与活化Akt及抑制PTEN蛋白表达相关。

miR-153-3p靶向下调Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)基因抑制乳腺癌细胞增殖及迁移

目的探究miR-153-3p调节乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭的分子机制。方法利用生物信息学软件检索预测miR-153-3p的候选靶基因;采用双荧光素酶报告实验分析miR-153-3p与候选基因的靶向关系;应用实时荧光定量PCR和Western blot法检测miR-153-3p对MDA-MB-231细胞mRNA和蛋白质表达水平的影响;通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,并以TranswellTM检测细胞的迁移和侵袭能力。结果软件预测显示miR-153-3p与Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)有连续的结合区域;共转染miR-153-3p模拟物(miR-153-3p mimics)与ROCK1野生型报告载体的细胞相对荧光素酶活性降低;转染hsa-miR-153-3p-mimics后,MDA-MB-231细胞的miR-153-3p表达水平显著增高,且ROCK1蛋白的表达量明显降低。与对照组相比,转染组MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力均减弱。结论miR-153-3p通过靶向下调ROCK1的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。