基于NF-κB信号通路的玉屏风散加味含药血清对RLE-6TN细胞炎症反应的影响

目的观察玉屏风散加味含药血清对大鼠肺上皮Ⅱ型细胞RLE-6TN炎症反应的影响,基于核因子(NF)-κB信号通路探讨其作用机制。方法采用脂多糖诱导RLE-6TN细胞炎症反应,将细胞分为对照组、模型组、地塞米松血清组和5%、10%、20%中药血清组,分别以不同血清干预细胞24 h。试剂盒检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)含量,荧光染色检测细胞活性氧(ROS)含量,Hoechst/PI双染观察细胞凋亡情况,ELISA检测细胞上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β含量,RT-qPCR检测细胞Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA表达,Western blot检测细胞TLR4、MyD88、NF-κBp65、IκBα蛋白表达。结果与对照组比较,模型组RLE-6TN细胞上清液LDH、TNF-α、IL-6、IL-1β及细胞ROS含量显著升高(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),TLR4、MyD88 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01),IκBαmRNA表达显著降低(P<0.01),p-NF-κBp65/NF-κBp65、p-IκBα/IκBα比值显著升高(P<0.01);与模型组比较,20%中药血清组和地塞米松血清组细胞RLE-6TN细胞上清液LDH、TNF-α、IL-6、IL-1β及细胞ROS含量显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著降低(P<0.01),TLR4、MyD88 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),IκBαmRNA表达显著升高(P<0.01),p-NF-κBp65/NF-κBp65、p-IκBα/IκBα比值显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论玉屏风散加味含药血清可减轻RLE-6TN细胞炎症反应,其机制可能与调控NF-κB信号通路有关。

大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN诱导脂肪间充质干细胞体外分化

背景:研究表明,骨髓间充质干细胞具有在体外分化为肺泡上皮细胞的可能性,但至今未见脂肪间充质干细胞与肺泡上皮细胞通过长时间Transwell共培养,诱导脂肪间充质干细胞分化的相关报道。目的:观察大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞的可行性。方法:取3只SPF级健康雌性SD大鼠作为供体,分离、提取、培养、鉴定脂肪间充质干细胞。实验分2组:实验组(脂肪间充质干细胞与大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN进行Transwell共培养)和对照组(脂肪间充质干细胞单独培养)。共培养第21天,倒置显微镜观察各组脂肪间充质干细胞的形态变化,对脂肪间充质干细胞进行SP-C免疫荧光染色,荧光显微镜下观察蛋白表达并拍照,采用Image pro plus 6.0软件分析荧光表达的积分吸光度值。结果与结论:(1)共培养21 d,实验组的脂肪间充质干细胞形态由长梭形、成纤维细胞样,逐渐转化为卵圆形、多边形,对照组脂肪间充质干细胞形态保持成纤维细胞样;(2)荧光显微镜下观察,实验组脂肪间充质干细胞可见红色荧光表达,对照组无红色荧光表达,实验组的荧光表达较对照组增强(P<0.05);(3)结果表明,大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN能够在长时间(21 d)共培养条件下,诱导脂肪间充质干细胞分化为肺泡上皮细胞。

辛伐他丁通过PI3K/Akt通路上调血红素加氧酶-1表达对抗脂多糖诱导的RLE-6TN细胞损伤

目的:观察辛伐他丁(SIM)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN)损伤的保护作用及机制。方法:以离体培养RLE-6TN细胞为研究对象,观察SIM对RLE-6TN细胞血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响及机制。在HO-1表达最高时间点建立LPS炎症损伤模型,通过检测细胞活力和培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,观察SIM对LPS诱导的RLE-6TN细胞炎症损伤的保护作用。结果:与正常对照组相比,SIM组Akt磷酸化水平显著增加,并在处理后2h达到峰值。SIM可显著上调RLE-6TN细胞HO-1表达,mRNA和蛋白分别在处理后6h和12h到达峰值。PI3K/Akt抑制剂LY294002可显著抑制SIM对RLE-6TN细胞HO-1的上调作用。LPS处理可降低RLE-6TN细胞活力和增加培养液中LDH含量。SIM可显著减轻LPS对RLE-6TN的损伤,但这种保护作用可以被HO-1抑制剂Zn-pp显著抑制。结论:SIM可通过PI3K/Akt通路上调HO-1表达并对抗LPS诱导的RLE-6TN细胞损伤。

右归丸含药血清通过下调瘦素表达抑制RLE-6TN细胞上皮间质转化的机制研究

目的研究右归丸含药血清抑制香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)+转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的大鼠II型肺泡上皮细胞(RLE-6TN)上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用机制。方法RLE-6TN细胞经5%CSE处理12 h,再给予10 mg/L TGF-β1处理72 h建立EMT模型,给予5%、10%、15%、20%右归丸含药血清进行干预,采用CCK-8法测定细胞活力;采用免疫荧光法检测瘦素(leptin,LEP)表达;采用Western blotting检测LEP、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达。构建100 ng/mL LEP干预RLE-6TN细胞模型,给予10%右归丸含药血清进行干预,采用CCK-8法测定细胞活力;采用划痕实验测定细胞迁移能力;采用免疫荧光法检测E-cadherin、α-SMA表达;采用qRT-PCR法检测E-cadherin、α-SMA表达;采用Western blotting检测E-cadherin、α-SMA及Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信号传导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路相关蛋白表达。结果RLE-6TN细胞经5%CSE+10 mg/L TGF-β1干预后,LEP、α-SMA表达显著升高(P<0.01),E-cadherin表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,给予右归丸含药血清干预后,LEP、α-SMA表达显著降低(P<0.05、0.01),E-cadherin表达显著升高(P<0.05、0.01)。RLE-6TN细胞经100 ng/mL LEP干预后,细胞迁移率显著降低(P<0.01),α-SMA蛋白及mRNA的表达显著升高(P<0.01),E-cadherin蛋白及mRNA的表达显著降低(P<0.01),p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达显著升高(P<0.05、0.01);与模型组比较,给予10%右归丸含药血清干预后,细胞迁移率显著升高(P<0.01),α-SMA蛋白及mRNA的表达显著降低(P<0.05、0.01),E-cadherin蛋白及mRNA的表达显著升高(P<0.05、0.01),p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达显著降低(P<0.05、0.01)。结论右归丸含药血清能够通过降低LEP表达,抑制JAK2/STAT3信号通路,从而抑制RLE-6TN细胞EMT进程。

Vimentin,CTGF和AQP5在烟尘诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞恶性转化模型中的表达

目的观察波形蛋白(Vimentin)、结缔组织生长因子(conective tissue growth factor,CTGF)和水通道蛋白5(Aquaporin5,AQP5)在烟尘诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)恶性转化模型中的表达.方法以永生化ATⅡ(RLE-6TN细胞株)为实验对象,分为高剂量染毒组、低剂量染毒组和空白对照组.高、低剂量染毒组分别使用终浓度为200、50 mg/L的烟尘悬浊液在第1、3、5、7、9代对细胞染毒,同代对照组不加烟尘悬浊液同步培养.从第10代起,高、低剂量染毒组常规传代直至软琼脂克隆形成检测实验呈阳性.采用透射电镜观察细胞超微结构,以免疫印迹法及免疫组织化学法观察各组细胞肺表面活性蛋白SP(-B)、SP-C、波形蛋白(Vimentin)、结缔组织生长因子(CTGF)、水通道蛋白5(AQP5)表达.结果从形态改变、软琼脂克隆形成实验及肺泡表面活性蛋白(SP)-B、SP-C的表达上发现经烟尘诱导,RLE-6TN细胞超微结构会发生改变,且高、低剂量染毒组克隆形成率与染毒培养代数相关性有统计学意义(P<0.01),但与烟尘染毒水平相关性无统计学意义(P>0.05).免疫组织化学显示高、低剂量染毒组第30代细胞CTGF阳性、SP-B阴性,空白对照组CTGF阴性、SP-B阳性.Western blot示高、低剂量染毒组第25、30、35代细胞及空白对照组Vimentin和AQP5均为阴性.结论云锡炼厂烟尘导致ATⅡ恶性转化模型中CTGF表达阳性,但Vimintin及AQP5的表达呈阴性.

大鼠肺上皮细胞体外机械拉伸损伤模型的建立与评价

目的建立大鼠肺上皮细胞体外周期性机械拉伸损伤模型,为探讨机械通气所致肺损伤的过程及其机制提供模型基础。方法应用Flexercell-4000T^(TM)细胞柔性基底加载系统拉伸大鼠肺上皮Ⅱ型细胞株,随机分为对照组(C组)和机械拉伸组(S组),每组又分为4个亚组,3 h组(3C组、3S组)、6 h组(6C组、6S组)、16 h组(16C组、16S组)和24 h组(24C组、24S组)。机械拉伸组设定拉伸幅度为20%,频率为0. 3 Hz的正弦波并持续拉伸相应的时间。检测各组的细胞凋亡率、细胞上清液中TNF-α含量并观察形态学改变。结果与各自对照组相比,机械拉伸组细胞凋亡率均增加,TNF-α表达均增多(P <0. 05)。电镜下可观察到同趋势的细胞形态学损伤,以24 h机械拉伸组为著。结论应用Flexercell-4000TTM细胞柔性基底加载系统以拉伸幅度为20%、拉伸频率为0. 3 Hz的强度,持续24 h可建立有效的大鼠肺上皮细胞体外机械拉伸损伤模型。

烟尘慢性染毒致肺泡Ⅱ型上皮细胞恶性转化离体实验研究

目的建立模仿肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)暴露于云锡炼厂烟尘环境的离体研究模型。方法以永生化ATⅡ(RLE-6TN细胞株)为实验对象,分为高、低剂量染毒组和空白对照组。前2组分别使用终浓度为200、50 mg/L的烟尘悬浊液在第1、3、5、7、9代对细胞染毒,同代对照组不加烟尘悬浊液同步培养。从第10代起,高、低剂量染毒组常规传代直至软琼脂克隆形成检测实验呈阳性。采用透视电镜观察细胞超微结构,流式细胞术观察细胞周期,免疫印迹法及免疫组织化学观察各组细胞肺表面活性蛋白(SP)-B、SP-C、鼠双微体2(MDM2)蛋白、脆性组氨酸三联体(FHIT)蛋白的改变。结果染毒24 h后即可观察到烟尘对RLE-6TN细胞超微结构造成损伤,主要表现为板层小体变性且数量减少,以及细胞凋亡和坏死;转化后的细胞由圆形或类圆形铺路石样生长变为长梭形。高、低剂量染毒组细胞培养至25代时软琼脂克隆形成检测实验均呈阳性,克隆形成率分别为3.33‰和1.67‰;继续培养至35代观察高、低剂量染毒组克隆形成率分别为12.50‰和10.00‰,空白对照组始终没有克隆形成。高、低剂量染毒组克隆形成率与染毒培养代数相关性有统计学意义(P<0.01),但与烟尘染毒剂量相关性无统计学意义(P>0.05)。流式细胞仪检测示高、低剂量染毒组G2/M期+S期的比例较空白对照组增高。高、低剂量染毒组第25、30代细胞MDM2蛋白阳性、SP-B及FHIT蛋白阴性,而空白对照组同代细胞MDM2蛋白阴性、SP-B及FHIT蛋白阳性。高、低剂量染毒组第25、30、35代细胞示SP-C失表达,空白对照组SP-C有表达。结论 ATⅡ长期暴露于云锡炼厂烟尘中可导致其恶性转化。ATⅡ特异性蛋白SP-B、SP-C、FHIT失表达,MDM2阳性表达可作为RLE-6TN细胞转化的参考指标。

氮杂胞苷对射线诱导大鼠Ⅱ型肺上皮细胞系上皮间质转换的影响

目的 探讨氮杂胞苷对射线诱导大鼠Ⅱ型肺上皮细胞系（RLE-6TN）上皮间质转换的影响,并探究其发生机制,为放射性肺纤维化提供潜在的药物治疗实验依据.方法 体外培养RLE-6TN细胞根据实验目的分为对照组（C）、照射组（R）、氮杂胞苷组（A）、照射加氮杂胞苷组（R＋A）.细胞超微结构改变采用透视电子显微镜鉴定,细胞形态学改变采用倒置相差显微镜观察.运用实时荧光定量RT-PCR检测E-cadherin和α-SMA在mRNA水平的表达,运用蛋白印迹法检测E-cadherin、GSK3β、p-GSK3β（ser9）在蛋白水平的表达.单因素方差分析组间差异.结果 R组细胞形态趋于纺锤形,而R＋A变化不明显.R组嗜锇性板层小体最终消失.RT-PCR提示在mRNA水平R组相对C组E-cadherin表达减少[（0.23±0.06）∶ （1.00±0.00）,P=0.002]、α-SMA表达增多[（2.91±0.01）∶（1.00±0.00）,P=0.000],而R＋A组相对R组E-cadherin表达增加[（0.47±0.05）∶（1.00±0.00）,P=0.024]、α-SMA表达减少[（2.50±0.02）∶（1.00±0.00）,P=0.037）].蛋白印迹法结果显示R组相对C组E-cadherin在蛋白水平表达下调[（0.07±0.01）：（0.48±0.02）,P=0.028]、p-GSK3β表达上调[（0.85±0.04）∶（0.23±0.03）,P=0.031],而R＋A组相对R组E-cadherin表达下降[（0.25±0.00）∶（0.07±0.01）,P=0.024）]、p-GSK3β表达上调程度明显减少[（0.39±0.03）∶（0.85 ±0.04）,P=0.014].结论 X射线可引起上皮细胞上皮间质转换,而氮杂胞苷通过抑制p-GSK3β活性来抑制放射诱导的RLE-6TN细胞上皮间质转换的发展.

黄连素剂量依赖性抑制脂多糖刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞促凝和纤溶抑制因子的表达

目的探讨黄连素对脂多糖(LPS)刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)表达及分泌促凝和纤溶抑制相关因子的影响。方法体外培养大鼠AECⅡ细胞株RLE-6TN,取对数生长期细胞,用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测黄连素对细胞的毒性作用,根据半数抑制浓度(IC50)确定药物浓度范围。将对数生长期细胞分为5组:空白对照组使用DMEM培养基常规培养;LPS组在培养基中加入5 mg/L的LPS刺激细胞;黄连素预处理组先分别加入20、50、80μmol/L黄连素预处理1 h后,再加入5 mg/L的LPS共培养。LPS刺激24 h后收集细胞,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)及实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞组织因子(TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的蛋白和mRNA表达;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中活化蛋白C(APC)、Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)及抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的含量。结果根据抑制率曲线计算得出黄连素对RLE-6TN细胞的IC50为81.16μmol/L,故选择20、50、80μmol/L作为黄连素的干预浓度。与空白对照组相比,LPS刺激24 h后RLE-6TN细胞表达及分泌促凝和纤溶抑制相关因子异常,表现为TF、PAI-1的蛋白及mRNA表达水平均明显升高,TFPI的蛋白及mRNA表达水平明显降低;同时细胞上清液中APC、ATⅢ含量均明显降低,而PⅢP、TAT含量均明显升高。给予黄连素预处理后,LPS刺激诱导的RLE-6TN细胞表达及分泌促凝和纤溶抑制相关因子异常情况得到纠正,并呈现一定的剂量依赖性,以80μmol/L时作用更为显著;与LPS组相比,黄连素80μmol/L预处理组细胞中TF、PAI-1的蛋白及mRNA表达水平均明显降低〔TF蛋白(TF/GAPDH):0.45±0.02比0.55±0.03,TF mRNA(2^(-ΔΔCt)):0.39±0.08比1.48±0.11,PAI-1蛋白(PAI-1/GAPDH):0.37±0.02比0.64±0.04,PAI-1 mRNA(2^(-ΔΔCt)):1.14±0.29比4.18±0.44,均P<0.01〕,TFPI蛋白及mRNA表达水平明显升高〔TFPI蛋白(TFPI/GAPDH):0.53±0.02比0.45±0.02,TFPI mRNA(2^(-ΔΔCt)):0.94±0.08比0.40±0.05,均P<0.01〕;同时细胞上清液中APC、ATⅢ含量明显升高〔APC(μg/L):1358.5±26.0比994.2±23.1,ATⅢ(μg/L):118.0±7.4比84.4±2.7,均P<0.01〕,而PⅢP和TAT含量则均明显降低〔PⅢP(μg/L):11.2±0.4比18.6±0.9,TAT(ng/L):222.1±2.8比287.6±7.0,均P<0.01〕。结论黄连素可以剂量依赖性抑制LPS刺激下大鼠AECⅡ细胞促凝及纤溶抑制相关因子表达和分泌,促进抗凝因子表达和分泌,有望成为有效防治急性呼吸窘迫综合征(ARDS)肺泡过度促凝和纤溶抑制的新靶点。