基于SemlikiForest病毒RNA复制子的猪瘟RNA疫苗的初步研究

将猪瘟病毒E2基因克隆于我们此前构建的衍生于Semliki Forest病毒(semliki forest virus,SFV)RNA复制子的新型真核表达载体pSFV1CS中,获得重组质粒pSFV1CS-E2。用纯化的pSFV1CS-E2分别转染BHK-21细胞和293T细胞,经间接免疫荧光试验检测显示,CSFV E2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验结果表明,10μg或100μg pSFV1CS-E2可诱导小鼠产生猪瘟特异性抗体。

基于DNA和RNA的双功能Semliki森林病毒复制子载体的构建

以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFVhelper2为骨架,用CMVIE和T7启动子替换SP6启动子并在3′UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该表达载体可高水平表达外源基因,与辅助载体共转染可制备具有感染能力并能表达外源基因的重组病毒颗粒。构建的基于DNA和RNA的双功能复制子载体显著地提高SFV载体应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因及大规模制备重组病毒颗粒,在体内也可用于研制复制子疫苗和基因治疗载体。

乙肝病毒RNA复制子疫苗与DNA疫苗对小鼠免疫效率的比较

为建立并获取更有效的乙肝疫苗,本实验通过将所构建的HBVRNA复制子疫苗和DNA疫苗分别免疫小鼠,检测细胞免疫与体液免疫的效果。结果表明,以pSFV为基础构建的疫苗载体免疫小鼠后采集的血清中抗体效价不随免疫剂量的增加而提高,在较低剂量免疫的时候,RNA复制子疫苗所产生的抗体效价优于DNA疫苗。并且RNA复制子疫苗在以较低剂量免疫后脾细胞CTL活性高于DNA疫苗。本研究证明HBVRNA疫苗比DNA疫苗表达效果更好,安全性更高,更具有应用前景。

RNA复制子疫苗研究进展

最近兴起的RNA复制子疫苗,利用源自病毒的能够自主复制的RNA,其结构蛋白基因由外源抗原基因取代,保留了非结构蛋白(RNA复制酶)基因。RNA复制酶可使RNA载体在细胞质中高水平复制,并实现外源抗原基因的高水平表达,可同时诱导细胞免疫和体液免疫应答。大量双链RNA可诱导被感染细胞凋亡,宿主细胞的凋亡有利于免疫系统识别外源抗原。RNA复制子疫苗克服了传统疫苗和普通DNA疫苗存在的缺点,具有抗原表达效率高、安全性好、应用范围广等优点,因而被视为一种发展前景很好的疫苗形式。目前已对一些疾病模型基于复制子的治疗性和预防性疫苗进行了研究(涉及的对象包括病毒、肿瘤以及细菌毒素等),并对某些不足之处进行了改进。

RNA复制子疫苗

RNA复制子是自主复制的RNA ,保留了病毒复制酶基因 ,而结构蛋白基因缺失 ,由外源抗原基因取代 ,复制酶可控制载体RNA在胞浆中高水平复制和外源基因的高水平表达。用于开发复制子的主要是单股正链RNA病毒 ,如甲病毒 (辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒 )、黄病毒 (登革热病毒、昆津病毒 )、小RNA病毒 (脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒 )、副粘病毒 (犬瘟热病毒 )、杯状病毒 (猫杯状病毒 )。基于复制子的疫苗不会产生能复制的感染性病毒粒子 ,不可能与细胞基因组发生整合 ,但可诱导全身免疫和粘膜免疫以及MHC I限制性CTL反应 ,而不受体内已有载体抗体的干扰。目前已开发了大量基于复制子的疫苗和肿瘤的治疗性和预防性疫苗 ,并在很多疾病模型上取得成功 ,包括病毒 (流感病毒、人免疫缺陷病毒、拉沙病毒、马尔堡病毒、呼吸道合胞体病毒、诺沃克样病毒、马动脉炎病毒等 )肿瘤 (人乳头瘤、癌胚抗原、B1 6肿瘤、小鼠黑素瘤等 )、以及细菌毒素 (肉毒杆菌毒素、葡萄球菌肠毒素、破伤风毒素等 )。

猪2型圆环病毒ORF2基因在塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的新型真核表达载体中的表达

猪 2型圆环病毒 (porcinecircovirus 2 ,PCV2 )是断乳仔猪多系统衰竭综合征 (postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的原发性病原。PCV2的ORF2编码病毒唯一的结构蛋白Cap。根据GenBank中公布的PCV2JXL株的序列设计一对引物 ,应用PCR方法从该毒株感染的PK 15细胞中扩增出完整的ORF2基因 ,将此基因克隆于本实验室此前构建的塞姆利基森林病毒 (SemlikiForestvirus,SFV)RNA复制子衍生的新型真核表达载体pSFV1CS中的BamHⅠ位点 ,获得重组质粒pSFV1CS Cap。用pSFV1CS Cap分别转染BHK 2 1细胞和 2 93T细胞 ,经间接免疫荧光试验检测表明 ,PCV2ORF2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验表明 。

基于RNA复制子GHRH基因表达载体的构建及在293细胞中的表达

本研究将GHRH基因克隆到塞姆利基森林病毒(SFV)复制子质粒型表达载体pCMV-Rep-lacZ,构建了真核表达载体pCMV-Rep-GHRH。采用脂质体介导将表达质粒pCMV-Rep-GHRH转染293细胞,经RT-PCR、IFA、Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测,证明表达质粒pCMV-Rep-GHRH在293细胞中正确地表达了GH-RH多肽分子。本研究还利用放免法检测质粒载体转染细胞培养上清中GHRH浓度,初步比较了RNA复制子载体pCMV-Rep-GHRH和普通载体(pIRES-GHRH和pcDNA3-GHRH)的表达效率,结果表明,转染48 h,RNA复制子载体表达GHRH的含量显著高于普通载体,分别比pIRES-GHRH和pcDNA3-GHRH高出36.12%(P<0.05)和67.94%(P<0.05)。结论:构建的真核表达载体pCMV-Rep-GHRH能够在真核细胞293中表达GHRH多肽分子,且表达水平显著高于普通载体,为下一步更好地调控动物生长以提高动物生产性能奠定基础。

HBV RNA复制子疫苗、DNA疫苗在BHK-21细胞中表达情况的比较

为建立更有效的乙肝疫苗,通过将所构建的HBVRNA疫苗和DNA疫苗分别转染BHK-21细胞,并比较其在细胞中表达情况及细胞凋亡现象。以pSFV为基础构建的疫苗载体的表达效率高于以pcDNA3.1为基础构建的疫苗载体,pSFV为基础构建的疫苗载体出现细胞凋亡的现象。HBVRNA疫苗比DNA疫苗表达效果更好,安全性更高,更具有应用前景。

双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的克隆表达及其对丙型肝炎病毒蛋白合成的抑制作用

α干扰素为治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的主要药物,但部分患者呈干扰素耐受而不能获得持久的病毒阴转,其可能的原因之一是病毒通过其编码的蛋白(NS5A及E2)抑制干扰素诱导的抗病毒效应分子———双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的活性.而关于PKR是否在IFN-α抗HCV的机理中起抑制作用目前仍有争议.为研究PKR对HCV蛋白合成环节是否有抑制作用,通过构建野生型PKR真核表达载体(pPKRwt)及主要起负性调节作用的缺失突变PKR真核表达载体(pPKRΔ6),并将pPKRwt/pPKRΔ6与HCV复制子RNA同时转染Huh7细胞进行共表达,用Western印迹检测HCV IRES下游的NPTⅡ蛋白表达水平,与转染空载体的对照细胞及单用IFN-α处理的细胞相比较.结果显示:表达PKRwt的细胞中NPTⅡ蛋白水平低于转染空载体的对照细胞,但高于经IFN-α单独处理的细胞;表达PKRΔ6的细胞中NPTⅡ蛋白水平与对照细胞无明显差别,但PKRΔ能部分抵消IFN-α的抑制作用,说明在IFN-α抑制HCV IRES指导的蛋白合成中,PKR有一定的抑制作用,但可能还有其它的PKR非依赖机制参与.

基于SFVRNA复制子核酸疫苗pIRSFV-HN的构建及其体内外抑瘤作用

目的:构建基于塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)RNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN,并探讨其体内外的抑瘤作用。方法:基于SFV RNA复制子和新城疫病毒HN基因构建核酸疫苗pIRSFV-HN,pIRSFV-HN转染人结肠癌细胞HCT-116,以Western blotting检测转染后HCT-116细胞HN的表达水平,以AO/EB双荧光染色检测肿瘤细胞的凋亡,以MTT法检测疫苗对HCT-116细胞增殖的抑制。构建C57BL/6小鼠右后肢皮下荷H22腹水瘤细胞模型,瘤体内注射pIRSFV-HN(共3次),检测该小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平和特异性CTL活性。结果:成功构建基于SFV RNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN。结肠癌细胞HCT-116被疫苗转染后可有效表达HN蛋白,对照细胞则无表达;转染后HCT-116细胞出现凋亡的征象;该细胞的增殖受到明显抑制,最大抑制率达55.34%。移植瘤体内注射疫苗后,荷瘤小鼠血清IL-2、IFN-γ水平显著升高(P<0.05),其CTL活性也显著升高(P<0.01)。结论:基于SFVRNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN在体外可有效地抑制肿瘤细胞;在体内可促使免疫趋向Th1优势,提高其抑瘤免疫水平。

基于DNA的Semliki森林病毒复制子载体体内外高水平表达外源基因

基于DNA的复制子载体显著地提高了复制子载体的应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因,大规模制备重组病毒颗粒,在体内可用于复制子疫苗和基因治疗载体研究.将复制子RNA的cDNA置于RNA聚合酶Ⅱ启动子和转录终止子控制下时,基于RNA的复制子载体可转变为基于DNA的复制子载体.当DNA载体转染细胞后,第一阶段,RNA聚合酶Ⅱ启动子在核内起始合成RNA,经过加工和修饰后运输到细胞质中,相当于复制子RNA,第二阶段,该RNA自我复制及表达外源基因,相当于病毒RNA复制循环.在成功地构建了基于DNA和RNA的双功能复制子表达载体pSCTA和辅助载体pSHCTA的基础上,为了获得高效的基于DNA的复制子载体,对其进行改进而构建了共4种不同的基于DNA的semliki森林病毒复制子,通过对表达载体和相应的辅助载体表达报告基因及对制备重组病毒颗粒的能力进行比较,获得了复制能力提高的复制子载体pSCAR和pSHCAR.该表达载体pSCAR可高水平表达外源基因,与辅助载体pSHCAR共转染可制备高滴度的重组病毒颗粒,并且也能表达抗原基因.另外,报告基因在DNA复制子载体注射的小鼠体内得到了高水平表达,并且DNA免疫小鼠后也诱导产生高滴度特异性抗体以及细胞免疫反应.结果表明,经过改造SFV复制子载体,获得了高效的基于DNA的SFV复制子载体.该复制子载体增强了原复制子载体应用能力,并有潜力作为复制子疫苗和基因治疗载体.

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。

“自杀性”DNA疫苗研究进展

DNA疫苗作为第三代全新的疫苗,具有传统疫苗和其他基因工程苗不可比拟的优点。但由于其安全性方面存在着一些尚待解决的问题,使得实际应用受到限制。“自杀性”DNA疫苗是基于常规的DNA疫苗和自主复制型RNA疫苗而发展起来的一种新型疫苗。由于其制备原理和过程与常规DNA疫苗相类似,所以它具备常规DNA疫苗在制作、运输储存以及免疫等各方面的优点。同时由于它以甲病毒复制子为基础能诱导转染细胞自主凋亡,故比常规DNA疫苗更为安全有效。文章针对“自杀性”DNA疫苗载体的构建、作用机理、优点以及国内外研究情况作一介绍。

A型肉毒毒素受体结合区Hc在重组SFV复制子载体中的表达

为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原,构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus,SFV)复制子表达栽体。RNA和DNA复制子栽体转染BHK21细胞后,经间接免疫荧光、Western印迹和ELISA检测,结果表明非分泌型和分泌型的Hc抗原在细胞中都得到了有效地表达;而且复制子表达载体与辅助病毒载体共转染均可制备高滴度的重组病毒颗粒,该重组病毒颗粒感染细胞后,也都能表达Hc抗原。以上结果表明,基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体在细胞中均可有效地表达Hc抗原和制备具有感染能力并能表达Hc抗原的重组病毒颗粒。基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体的构建和含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组病毒颗粒的获得,为进一步观察SFV复制子疫苗的免疫原性奠定了基础,从而为A型肉毒毒素新型疫苗的研制提供了新途经。

丙肝合剂对不同基因型丙型肝炎病毒复制子基因表达的影响

目的通过体外实验探讨丙肝合剂抑制不同基因型丙型肝炎病毒(HCV)复制子基因表达的机制。方法建立不同基因型HCV复制子细胞模型,按基因型不同分为HCV 1b组、HCV 2a组和J6/JFH1组,不同浓度丙肝合剂干预负载复制子的Huh7.5.1细胞48 h后,收集细胞裂解液,进行荧光素酶活性测定,MTT法检测细胞毒性。选择IFN-2α和DMSO分别作为阳性对照和阴性对照以排除实验误差。结果 3组荧光素酶活性呈剂量依赖性下降,3组比较差异有统计学意义(P<0.05)。多重比较显示,HCV 2a组荧光素酶活性显著低于HCV 1b组和J6/JFH1组(P<0.05)。MTT实验结果显示,丙肝合剂浓度达到0.2 g/m L时,细胞存活率超过99%。结论丙肝合剂能部分抑制不同基因型HCV结构基因的转录,对HCV 2a复制子抑制作用最强,丙肝合剂达到有效抑制作用的浓度为0.1 g/m L。

黄病毒属病毒复制子载体研究进展

RNA复制子是一种能自主复制的RNA载体,保留了病毒非结构蛋白(复制/转录酶)基因,而结构蛋白基因缺失或由外源抗原基因替代,复制/转录酶可控制载体RNA在细胞质中高水平复制以及外源基因的高水平表达。在黄病毒属病毒感染性克隆基础上,其复制子载体得到了成功的构建。黄病毒属病毒复制子为病毒基因组结构功能研究、表达载体构建、假病毒包装及新型疫苗制备等提供了新的技术平台。本文综述黄病毒属病毒复制子的构建原理、方法及应用。

基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体的构建

目的:以semliki森林病毒复制子为基础,构建一类可迅速高效表达shRNA的新型RNAi载体。方法:以Semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1为骨架,用CMV IE启动子替换SP6启动子并在3′-UTR下游插入SV40 polyA转录终止子,在原26S亚基因组启动子后插入带有相应改良多克隆位点的shRNA表达元件,同时加入抗新霉素选择复合体,并去掉3′-UTR的重复序列。所获载体用于沉默EGFP基因,通过体外细胞转染、病毒颗粒制备、荧光显微镜观察、RT-PCR分析等初步验证、评估其效果。结果:构建了基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体pSFV-RNAi Ready。经体外实验初步证实,该载体直接转染细胞,或与辅助载体共转染,制备成具有感染能力的重组病毒颗粒后使用,均可高水平表达shRNA,沉默目的基因。其中使用病毒颗粒抑抑效率可高达90%以上。结论:该载体的成功构建,可望显著拓宽SFV载体的应用范围,丰富RNAi实施手段,并用于相关科学研究及基因药物技术开发。

登革病毒C基因突变对病毒RNA复制的影响

目的:分析C基因及其编码蛋白突变对登革病毒RNA复制的影响。方法:利用融合PCR方法在登革病毒复制子中引入C基因相应部位的缺失突变,将复制子RNA转染细胞后,利用报告基因活性分析、间接免疫荧光及实时定量PCR等方法分析其复制水平。结果:获得了含有不同α螺旋缺失突变的C基因的复制子质粒,并发现Δα1复制子复制水平明显下降。结论:登革病毒C蛋白α1螺旋或其编码序列对病毒RNA复制具有重要作用。

利用RNA复制子融合表达口蹄疫病毒抗原表位与分子内佐剂的研究及其表达产物的免疫学分析

为了探究新型疫苗载体在口蹄疫防控中的应用,本研究构建了一种融合表达口蹄疫病毒抗原表位与分子内佐剂的RNA复制子。首先将FMDV毒株O/BY/2010 B、T表位及霍乱毒素B和α-干扰素基因构建到RNA复制子载体中,通过将复制子质粒线性化并进行体外转录,得到复制子RNA。将该RNA转染BHK-21细胞,用Western-blot以及RT-PCR验证其正确表达后,选择不同佐剂免疫小鼠,用ELISA检测特异性抗体的产生。结果,重组复制子能够在BHK-21细胞内正常表达,免疫小鼠后能够诱导产生特异性抗体。综上所述,本研究构建的重组RNA复制子能够表达FMDV抗原表位与分子内佐剂,为口蹄疫RNA疫苗的研制提供了理论基础。

西尼罗病毒RNA复制子系统的建立与应用

目的构建具有复制和表达活性的RNA形式的西尼罗病毒(WNV)复制子。方法在DNA形式的WNV复制子pWNrep的基础上,将其CMV启动子替换成SP6启动子,并在3'UTR端引入PacⅠ酶切位点,构建复制子克隆pSP6-WNrep。同时,将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和海肾荧光素酶(R.luc)报告基因分别插入上述复制子质粒中,获得含有报告基因的复制子pSP6-WNrep/eGFP和pSP6-WNrep/R.luc。将上述克隆线性化后进行体外转录,将转录体RNA转染BHK-21细胞,观察不同时间点绿色荧光蛋白(GFP)的活性和R.luc活性。结果与结论获得了WNV复制子pSP6-WNrep、pSP6-WNrep/eGFP和pSP6-WNrep/R.luc,酶切和测序鉴定结果显示,序列与预期一致。将含有报告基因的复制子转染细胞72 h后仍能观察到荧光信号,R.luc的活性随时间延长而增强。本研究成功构建了WNV Chin-01株的RNA复制子,该复制子能够在哺乳动物细胞中有效复制并表达外源蛋白,为下一步构建WNV单轮感染病毒样颗粒奠定了基础。