shRNA沉寂HK-Ⅱ表达对胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡的影响

目的:观察shRNA沉寂HK-Ⅱ基因的表达对胃癌细胞株SGC7901细胞增殖、凋亡的影响,初步评价HK-Ⅱ基因治疗胃癌的应用前景.方法:取胃癌细胞株SGC7901及胃上皮细胞株GES-1细胞为研究对象,将每株细胞分别分成5组(A:干扰组;B:阳性对照组;C:阴性对照组;D:脂质体组;E:空白对照组).用shRNA沉寂胃癌细胞株SGC7901及胃上皮细胞株GES-1细胞中HK-Ⅱ的表达.用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染shRNA后每株细胞中各组HK-ⅡmRNA的表达变化;分别用MTT及流式细胞仪检测转染后细胞增殖、凋亡的变化.结果:HK-ⅡmRNA在胃癌细胞株SGC7901细胞中的表达明显高于胃上皮细胞株GES-1细胞(t=12.119,P<0.01),HK-ⅡshRNA可以明显抑制两株细胞中HK-Ⅱ的表达(P<0.01).沉寂HK-Ⅱ的表达可抑制SGC7901细胞的增殖(F=159.811,P<0.01),并促进其凋亡(χ2=21.324,P<0.01);但对胃上皮细胞增殖(F=0.704,P=0.592)及凋亡(χ2=1.007,P=0.909)无明显影响.结论:沉寂HK-Ⅱ表达可以抑制胃癌细胞株SGC7901的增殖,促进其凋亡;但对胃上皮细胞株GES-1无明显影响.HK-Ⅱ可能成为胃癌治疗的一个靶点.

膀胱癌肿瘤组织中bcl-x基因mRNA的表达及其临床意义

【目的】研究凋亡调控基因bcl x在膀胱癌患者肿瘤组织中的表达情况 ,探索bcl x基因的异常表达与膀胱癌的发病、演进和复发的关系。【方法】应用半定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测 30例膀胱癌患者新鲜肿瘤组织和 10例膀胱正常组织标本中bcl x基因mRNA的表达情况。【结果】2 1例膀胱癌组织标本表达bcl xl(70 % ) ,12例表达bcl xs(4 0 % ) ,bcl xl基因mRNA平均表达量明显高于bcl xs基因 ,膀胱癌组织中bcl xs基因与bcl xl基因在表达上呈正相关 ;2例膀胱正常组织标本表达bcl xl(2 0 % ) ,无表达bcl xs者。不同病理分级和病理分期的膀胱癌组织中bcl x基因表达无显著性差异。【结论】膀胱癌组织普遍表达bcl xl基因 ,部分表达bcl xs基因 ,bcl xl基因的表达处于优势地位。膀胱癌的发病与bcl xs无关 ,而与凋亡抑制基因bcl xl的高表达有关。bcl xl基因与膀胱癌的演进和复发有关 ,可作为预计其术后复发风险的一项重要指标。

骨桥蛋白对骨关节炎软骨细胞缺氧诱导因子-2α mRNA表达的影响

[目的]本研究探讨在体外实验中，骨桥蛋白（OPN）对缺氧诱导因子-2α（HIF-2α）在软骨细胞表达的影响，揭示OPN在骨关节炎（OA）发病中的作用机制。[方法]从OA患者胫骨表面切取软骨，并在体外培养纯化软骨细胞。用重组人类骨桥蛋白（rhOPN组）和小干扰RNA（siRNA组）对软骨细胞进行干预（对照组不予激活及干预），检测HIF-2αmRNA表达的变化。用抗-CD44单克隆抗体检测可能的配体-受体的相互作用。通过实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）同时定量软骨细胞OPNmRNA和HIF-2αmRNA的表达。[结果]rhOPN组与对照组相比，HIF-2αmRNA的表达水平显著降低，相反，siRNA组HIF-2αmRNA表达增加。同时，CD44抗体可以抑制0PN对HIF-2αmRNA的表达的影响。[结论]OPN可能通过CD44的相互作用，抑制0A软骨细胞HIF-2αmRNA的表达，从而发挥对0A的保护性作用。

Bcl-2 mRNA和Bax mRNA在增生性瘢痕中的表达及意义

【目的】观察Bcl-2 mRNA和Bax mRNA在增生性瘢痕和正常皮肤组织内的表达特征及其对增生性瘢痕形成的影响。【方法】收集20例增生性瘢痕和20例正常皮肤组织,常规制作石蜡包埋切片,Bcl-2 mR-NA和Bax mRNA染色方法为分子原位杂交染色法。【结果】Bcl-2 mRNA和Bax mRNA杂交信号阳性产物定位于胞浆。增生性瘢痕Bcl-2 mRNA表达阳性率及其评分明显高于正常皮肤(P<0.01);增生性瘢痕BaxmRNA表达阳性率及其评分与正常皮肤无明显差异(P>0.05)。【结论】Bcl-2基因表达增强可能是瘢痕中细胞凋亡减少,形成增生性瘢痕的机制之一。

子宫内膜癌中CYP1A1，CYP1B1及COMT mRNA的表达及临床意义

[目的]探讨细胞色素P450酶（CYP）1A1, 1B1和儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT） mRNA的表达与子宫内膜癌发生发展的关系.[方法]采用RT-PCR方法检测48例子宫内膜癌患者和53例健康对照个体的外周血淋巴细胞中CYP1A1,CYP1B1和COMT mRNA的表达.[结果]子宫内膜癌患者外周血淋巴细胞中CYP1A1,CYP1B1 mRNA的表达明显增高,经Logistic回归分析后, CYP1B1 mRNA的高表达能增加子宫内膜癌的发病风险,进一步分析显示Ⅱ期子宫内膜癌CYP1B1 mRNA的表达高于Ⅰ期患者,差异具有显著性意义.[结论]外周血淋巴细胞中CYP1B1 mRNA的高表达与子宫内膜癌的发生发展密切相关.

大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体的构建与测序

【目的】构建测序大鼠视黄醇结合蛋白-1(CRBP-1)基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体。【方法】针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNA干扰(RNAi)有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒载体,命名为Lv-shCRBP-1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。【结果】PCR鉴定与DNA测序证实合成的Lv-shCRBP-1寡核苷酸链插入正确。【结论】成功构建大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体。

人IFN-λ1-3型mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立人IFN‐λ1‐3型mRNA实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT‐PCR）检测方法。【方法】根据人IFN‐λ1‐3型mRNA的基因序列合成特异性引物及探针，用体外转录方法制备IFN‐λ1‐3型的mRNA标准品，建立人IFN‐λ1‐3型mRNA qRT‐PCR检测方法。【结果】IFN‐λ1‐3型RNA标准品与对应的CT 值有良好的线性关系；扩增效率均在90％～100％之间；灵敏度分别是：1×10^0 co pies／μL、1×10^1 co pies／μL、1×10^1 co pies／μL ；变异系数均小于2％；各型间交叉反应不明显。【结论】本研究建立的IFN‐λ1‐3型mRNA qRT‐PCR检测方法灵敏度高，具有良好的重复性及特异性。

螺内酯对2型糖尿病大鼠血管PAI-1 mRNA表达的影响

[目的]4g讨非选择性醛固酮（aldsterone，ALD）受体拮抗剂-螺内酯（spironolactone，SPI）对2型糖尿病（type2diabeticmellitus，T2DM）大鼠血管纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogenactivatorinhibitor-1，PAI-1）tuRNA的表达的影响。【方法】高脂高糖喂养加小剂量链脲佐菌素（streptozotocin，STz）腹腔注射法建立2型糖尿病大鼠模型，将成膜的T2DM大鼠随机分为糖尿病对照组（DM—C组）和SPI干预组（DM_S组），继续高脂高糖喂养，正常对照组（NC组）大鼠继续给予普通饲料喂养，其中DM—s组每天给予SPI40rag／（kg·d）灌胃，NC纽和DM—c组每天等量蒸馏水灌胃。每2周监测大鼠体重和血糖水平，第16周末处死大鼠，收集血液标本，检测空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbAlC％）、甘油三酯（TG）、胆固醇（TG）、血钾（K’）。用RT—PCR法检测各组大鼠胸主动脉PAI-1mRNA表达。【结果】DM-C组和DM_S组大鼠FBG、HbAlC％、TG均显著高于NC组（P〈0．01），而DM—s组和DM—C组比较差异无统计学意义（P〉0．05）；三组之间的血K’水平比较差异无统计学意义（P〉0．05）；DM—C组和DM—S组大鼠胸主动脉PAI-1mRNA的表达显著高于NC组（P〈0．01），且DM—C组高于DM—s组（P〈0．05）。【结论1SPI能通过下调T2DM大鼠主动脉PAI-1rnRNA的表达而发挥血管保护作用。

siRNA沉默VDAC1对MCF-7细胞增殖、周期的影响及其作用机制

【目的】观察siRNA沉默VDAC1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响。【方法】针对人VDAC1基因设计并合成siRNA,并将VDAC1-siRNA转染MCF-7细胞后,应用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测MCF-7细胞中VDAC1的表达水平,MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况,流式细胞术检测MCF-7细胞的周期分布,同时Western印迹法检测周期蛋白D1的表达。【结果】MCF-7细胞转染VDAC1-siRNA后能够有效抑制VDAC1的表达,显著抑制其增殖水平,促使MCF-7细胞发生G1期阻滞,同时下调Cyclin D1蛋白表达。【结论】VDAC1沉默能够有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,促使细胞发生G1期阻滞。VDAC1可作为乳腺癌治疗的新靶点。

LncRNA AC007009.1与非小细胞肺癌临床分期相关性研究

【目的】研究lncRNA AC007009.1与非小细胞肺癌(NSCLC)临床分期的相关性。【方法】选取本院2015年10月至2019年4月收治的150例NSCLC患者为研究对象。收集患者手术后标本癌组织,对其lncRNA AC007009.1进行检测,以lncRNA AC007009.1水平中位数(5.24±2.05)取临界值(5.23),将其分为lncRNA AC007009.1高表达组(n=93)与lncRNA AC007009.1低表达组(n=57),对两组患者临床病理学特征(年龄、性别、临床分期、是否存在远处转移、吸烟史、酗酒史、肿瘤大小)进行分析,并将有差异的信息纳入Logistic回归性分析,分析lncRNA AC007009.1高表达的危险因素,明确NACLC病理特征与lncRNA AC007009.1的关系。【结果】高表达组年龄>60岁、远处无转移、临床分期Ul或W期、吸烟的患者显著多于低表达组患者,差异有统计学意义(P<0.05);两组性别、酗酒史、肿瘤大小对比差异无统计学意义(P>0.05)。Logistic回归性分析结果表明,年龄>60岁、远处无转移、临床分期I或W期、有吸烟史是lncRNA AC007009.1高表达的的危险因素。【结论】LncRNA AC007009.1与NSCLC的年龄、临床分期、远处转移、吸烟史密切相关,可作为NSCLC早期评估的重要指标,具有较高的临床应用价值。

转化生长因子β1小干扰RNA对肝星状细胞生物学特性的影响

目的 观察转化生长因子β1小干扰RNA（TGFβ1 siRNA）对肝星状细胞增殖、活化、胶原合成的影响.方法 利用脂质体将TGFβ1 siRNA表达质粒转入肝星状细胞中,培养72 h后,收集肝星状细胞和上清液,采用Western blotting和RT-PCR法分别检测细胞TGFβ1和a-SMA蛋白表达、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;MTT法检测细胞增殖活性和放射免疫法检测培养上清液中IV型胶原和透明质酸含量.结果 与无关对照siRNA组相比,TGFβ1和a-SMA蛋白表达分别下调（79±5）%和（55±4）%（均P〈0.01）;细胞增殖活性降低（25±4）%（P〈0.01）;Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调（63±6）%和（57±4）%（均P〈0.01）;培养上清中IV型前胶原和透明质酸含量分别降低（53±8）%和（46±8）%（均P〈0.01）.结论 TGFβ1 siRNA能显著下调TGFβ1的表达,抑制肝星状细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌.

miR-7对Hp诱导胃上皮细胞自噬及EMT的影响

目的探讨微小RNA-7(miR-7)对幽门螺杆菌(Hp)诱导的胃上皮细胞(GES-1)自噬及上皮细胞间质转化(EMT)的影响。方法体外将Hp悉尼株(SS1)与GES-1细胞共培养建立GES-1细胞转化模型;实验分为空白对照组(NC组)、Hp组、miR-7模拟物(mimics)组、Hp+miR-7 mimics组。qRT-PCR验证转染效果;MTT法、划痕实验、Transwell实验检测各组GES-1细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力;透射电镜下观察细胞自噬体;免疫印迹法检测各组GES-1细胞自噬相关蛋白[RM-9106微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、LC3-Ⅱ]及EMT相关蛋白[E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)]表达情况。结果与NC组比较,Hp组GES-1转化细胞增殖抑制率、p62蛋白、E-Cadherin蛋白水平降低(P<0.05),迁移率、侵袭数、自噬体数量及自噬泡/胞质总面积、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、N-Cadherin和Vimentin蛋白水平均升高(P<0.05),miR-7 mimics组GES-1细胞增殖抑制率、p62蛋白、E-Cadherin蛋白水平升高(P<0.05),迁移率、侵袭数、自噬体数量及自噬泡/胞质总面积、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、N-Cadherin和Vimentin蛋白水平均降低(P<0.05);与miR-7 mimics组比较,Hp+miR-7 mimics组转化细胞增殖抑制率、p62蛋白、E-Cadherin蛋白水平降低(P<0.05),迁移率、侵袭数、自噬体数量及自噬泡/胞质总面积、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、N-Cadherin和Vimentin蛋白水平均升高(P<0.05)。结论miR-7下调Hp诱导的GES-1细胞自噬,降低细胞侵袭及迁移能力,抑制EMT。

常用口服避孕药对人体rRNA基因功能的影响

应用银染-Ⅱ技术,对长期口服“避孕片2号”、“避孕片0号”及对照组各八例健康妇女的染色体核仁形成区,与近端着丝粒染色体联合进行了研究。结果提示:常用国产口服避孕药对人体rRNA基因功能和近端着丝粒染色体联合未见有明显影响。

shRNA沉默VEGF—C基因对大肠癌淋巴管生成和淋巴结转移的影响

目的 观察RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术抑制大肠癌细胞株Lovo中VEGF-C基因的表达,探讨抑制shRNA-VEGF-C对人大肠癌细胞Lovo生物学特性的影响.方法 构建表达ShRNA-VEGF-C重组质粒转染Lovo细胞,72 h后用实时RT-PCR（real-time polymerase chain recation）检测VEGF-C mRNA表达;建立Lovo细胞皮下移植瘤裸鼠模型,注射shRNA-VEGF-C,动态观察肿瘤体积并于4周后处死裸鼠称取瘤重、计算局部淋巴结转移率,免疫组化法检测大肠癌组织微淋巴管密度（microlymphatic density,MLD）.结果 转染shRNA-VEGF-C后,Lovo细胞VEGF-C mRNA表达下调;体内实验结果显示,4周后shRNA-VEGF-C组移植瘤体积[（324.9±64.8）mm3]明显小于空质粒组[（553.5±90.1）mm3]和生理盐水对照组[（570.1±85.4）mm3]（P〈0.01）;shRNA-VEGF-C组瘤重[（3.01±0.55）g]也低于空质粒组[（4.65±0.65）g]和生理盐水对照组[（4.75±0.55）g]（P〈0.01）;shRNA-VEGF-C组微淋巴管密度LMVD（15.5±6.90）明显低于HK组（24.18±6.45）和生理盐水对照组（29.59±8.21）（P〈0.01）;shRNA-VEGF-C组局部淋巴结转移率（30.1%）明显低于空质粒组（50.2%）和生理盐水组（53.1%）.结论 shRNA-VEGF-C可影响VEGF-C诱导的淋巴管生成并抑制大肠癌淋巴结转移.

基于转录组测序(RNA-seq)技术研究新加香薷饮合柴葛解肌汤加减治疗登革热的分子机制

【目的】探讨新加香薷饮合柴葛解肌汤加减治疗登革热的分子机理。【方法】收集广州市花都区人民医院2018年1月至12月登革热患者6例(治疗前设为登革热组,治疗后设为中药治疗组),另收集正常人6例作为正常对照组。应用转录组测序(RNA-seq)技术检测各组mRNA表达情况,比较登革热组与正常对照组获得差异基因,比较中药治疗组与登革热组获得差异基因,再获得两者的交集基因,进行表达模式分析、功能富集分析以及蛋白与蛋白相互作用网络分析以获取起关键作用的基因。【结果】筛选到登革热组与正常对照组比较的差异基因2 704个,中药治疗组与登革热组比较的差异基因882个,筛选出中药逆转的潜在靶基因279个。基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析发现,这些基因大多参与了炎症、自身免疫应答相关功能,如干扰素应答反应、维甲酸诱导基因I(RIG-I)样受体信号通路和T细胞活化的调节。另外,通过蛋白与蛋白网络分析确定了这些基因间的相互作用关系并筛选到45个可能起关键作用的基因,如IRF7、CCL2、IL15等。【结论】新加香薷饮合柴葛解肌汤加减治疗登革热的机制可能与其调节炎症、自身免疫应答相关的基因和信号通路有关。

构建人 COX-2反义核酸真核表达载体对膀胱癌 T24细胞株COX-2表达的作用

【目的】构建人环氧化酶-2（COX-2）反义核酸真核表达载体，探讨其抑制膀胱癌 T24细胞COX-2表达的作用。【方法】经PCR法从含人COX-2基因的质粒中扩增其cDNA ，通过限制性内切酶克隆于 T载体EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ位点之间，并将其反向插入pcDNA3．1中获得重组质粒。应用脂质体介导将其导入T24膀胱癌细胞中，经过G418筛后进行流式细胞术、间接免疫荧光染色和RT-PCR鉴定。【结果】核酸测序和限制性内切酶消化证实重组COX-2反义核酸真核表达质粒 pcDNA3．1/COX-2 as是正确的，经鉴定转导 pcD-NA3/COX-2 as的T24细胞中环氧化酶-2的表达明显抑制。【结论】成功构建人COX-2反义核酸真核表达载体并获得环氧化酶-2基因表达持续下调的膀胱癌细胞株T24-AS。

结肠癌相关转录子2的调控机制及与消化系统肿瘤关系的研究进展

结肠癌相关转录子2(CCAT2)是新近发现的肿瘤相关长链非编码RNA(lncRNA)中的一个重要成员。异常表达于肿瘤组织细胞中的CCAT2在肿瘤病理过程中,尤其是消化道肿瘤发生发展中发挥着重要的调控作用,有望成为新型的肿瘤标志物和治疗靶点。阐明CCAT2的作用机制将为肿瘤的诊断和治疗提供可行的理论依据与潜在的干预靶点。本文就CCAT2在消化系统肿瘤中的研究现状作一综述。

EGFL7基因沉默对裸鼠胃癌血管生成的影响

目的 探讨类表皮生长因子域7（EGFL7）基因沉默对胃癌裸鼠模型瘤内血管生成的影响.方法 构建EGFL7短发夹状RNA表达质粒并转染SGC-7901细胞（psh EGFL7组）,以空质粒转染为对照组.观察两组皮下种植瘤生长曲线及体积.免疫组织化学法检测抗-CD34、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板反应蛋白（TSP1）表达;RT-PCR检测MMP-2和TIMP2表达.结果 psh EGFL7组种植瘤体积为（1.86±0.65）cm^3,微血管密度（MVD）为20.84±6.38,分级为1～2级,对照组体积为（4.86±1.15）cm^3,MVD为39.48±9.01,分级为3～4级,两组种植瘤体积、MVD和分级的差异有统计学意义（P＜0.05）.EGFL7组TSP1蛋白阳性表达,而VEGF蛋白为弱阳性或阴性表达,MMP-2 mRNA表达下调,而TIMP2 mRNA表达上调,与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 EGFL7基因沉默可降低胃癌种植瘤血管生成,与调节MMP-2/TIMP2表达,影响VEGF/TSP1平衡有关.

NONHSA1254644在肺腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨长链非编码RNA NONHSA1254644在肺腺癌中的表达及临床意义。方法选取99例肺腺癌患者的癌组织和配对的癌旁组织并收集患者的临床资料,qRT-PCR检测其表达水平,随后分析其表达量与临床参数的关系,并采用CCK8实验探讨其对肺腺癌细胞系A549增殖的影响。结果 NONHSA1254644在肺腺癌中表达下调,其表达量与患者的分化呈正相关,过表达NONHSA1254644能抑制A549细胞的增殖。结论 NONHSA1254644参与肺腺癌的发生和发展过程。

沉默叉头盒O类转录因子-3a对卵巢癌SKOV3细胞系肿瘤球形成能力的影响

目的 探讨沉默叉头盒O类转录因子-3a（FoxO3a）活性是否影响人卵巢癌SKOV3细胞系肿瘤球形成能力.方法 干细胞条件培养基悬浮培养法得到SKOV3细胞系球形成细胞.FoxO3a特异性siRNA转染SKOV3细胞,Western blot分析FoxO3a磷酸化水平和Bmi1蛋白表达,肿瘤球形成法检测肿瘤球形成率.结果 与亲本细胞相比,SKOV3细胞系球形成细胞具有更高肿瘤球形成率并高表达磷酸化FoxO3a和Bmi1蛋白.FoxO3a特异性siRNA转染抑制FoxO3a蛋白表达,并上调Bmi1蛋白表达,增强肿瘤球形成能力.结论 沉默FoxO3a导致SKOV3细胞系肿瘤球形成能力增强.