高山离子芥冷诱导基因转化甘蔗二元植物表达载体构建

【目的】利用载体重组技术分别将高山离子芥冷诱导基因(Cbcor15a)和报告基因eGFP插入载体pCambia1300-bar,并引入玉米泛素基因启动子UBi-1代替载体本身启动子CaMV35s,重组为适合甘蔗转基因的二元植物表达载体pCambia1300-cbcor15a-bar。【方法】参照pCambia1300-bar载体多克隆位点和基因Cbcor15a、eGFP和启动子UBi-1的核苷酸序列设计引物,通过载体重组技术将基因和启动子分别插入相应的位点。利用基因枪分别将pCambia1300-bar载体和重组载体导入洋葱表皮细胞,用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察。【结果】与导入pCambia1300-bar载体的洋葱表皮细胞相比较,导入重组载体pCambia1300-cbcor15a-bar的洋葱表皮细胞内有强烈的绿色荧光信号。【结论】重组甘蔗转基因二元植物表达载体启动子Ubi-1能够调控下游冷诱导基因Cbcor15a和报告基因eGFP的正常高效表达,为外源基因Cbcor15a转化甘蔗提供保障。

PEI介导外源基因进入植物细胞的瞬时表达

【目的】医学方面的大量研究证实,聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为一种新型阳离子多聚物基因载体可以吸附和浓缩DNA,通过与细胞膜亲和粘附和细胞吞噬作用运载外源基因进入细胞并实现表达。本实验研究旨在探索PEI作为非病毒基因载体介导外源基因进入植物细胞并获得瞬时表达的可能性。【方法】制备PEI/DNA复合物,利用凝胶阻滞分析PEI与DNA的结合情况,采用电子显微镜观察PEI/DNA复合物的形态。以绿色荧光蛋白基因为报告基因研究不同N/P比条件下PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率,并与PEG转化方法进行比较分析。【结果】PEI与DNA的质量比为5﹕1～1﹕4,PEI可以与DNA稳定结合,形成粒径约100～200nm的球形复合物。PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率随其N/P比的增大而提高,N/P=5时PEI的转化效率达到最高且明显高于PEG介导的转化效率,N/P>5时转化效率反而下降,容易使细胞破碎和变形。【结论】PEI作为一种新型的外源基因运送载体对拟南芥原生质体细胞具有良好的介导基因转移效果。

紫花苜蓿WRKY转录因子基因的克隆与亚细胞定位

WRKY转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和RT-PCR结合的方法获得1个紫花苜蓿WRKY转录因子家族成员的cDNA序列,命名为MsWRKY56。该序列长1 267bp,包含1个951bp的最大开放阅读框,编码317个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编码蛋白进行亚细胞定位研究,结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。

甘薯叶绿体表达载体构建及其融合基因在叶绿体中的瞬间表达

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计引物,从甘薯(Ipomoeabatatas)叶绿体基因组中克隆了2个相邻的功能基因rbcL(GenBank登录号为AY942199)和accD(GenBank登录号为AY942200),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以来自叶绿体基因组的强启动子Prrn和Rps-bA-pro分别驱动选择标记基因aadA及phaC-gfp融合基因,构建成表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter与RpsbA-pro-phaC-gfp-RpsbA-ter,然后将这2个表达盒串联在一起克隆进甘薯叶绿体同源片段中,获得甘薯叶绿体定点整合表达载体pSC-GFP。酶切分析证明,所构建的载体符合预期设计;采用该载体对甘薯叶片进行基因枪转化,结果显示,phaC-gfp融合基因可在叶绿体特异启动子和终止子的调控下在甘薯幼嫩叶片中瞬间表达,证明构建的载体pSC-GFP可用于甘薯叶绿体转化。

马铃薯质体表达载体构建及GFP基因在块茎中的瞬时表达

利用高等植物质体基因组在进化中高度保守的特点,根据烟草质体基因组全序列设计合成引物,PCR扩增并克隆了马铃薯质体的trnI-trnA基因片段。将测序正确的trnI基因和trnA基因作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建成包含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的马铃薯质体定点转化载体pBMLSIA-GFP,酶切鉴定表明,所构建载体符合预期设计。采用该载体对马铃薯块茎进行基因枪法转化,结果表明,GFP基因可在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下在马铃薯块茎中瞬时高量表达,经基因枪轰击后马铃薯块茎在紫外投射仪下产生很强的绿色荧光,在距离为6cm,压力1100psi轰击2枪的条件下产生的绿色荧光最强。马铃薯块茎可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析表明,GFP蛋白表达量约占总可溶性蛋白的15.4%-30.2%,均达到了较高的表达水平。该载体对后期马铃薯质体转化体系的建立和其他功能基因导入马铃薯质体进行性状改良具有重要应用价值。

棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达。采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达。为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础。

蚓激酶基因在山羊乳腺中的瞬时表达

构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和蚓激酶基因cDNA的乳腺表达载体pβLK.通过直接注射将重组载体DNA导入山羊的乳腺组织,以纤维蛋白平板法测定乳汁中蚓激酶基因表达产物的活性.实验证实蚓激酶基因可以在山羊乳腺中瞬时表达.在进行山羊乳腺的瞬时表达时,适宜的注射剂量为500μg/ml.注射后6～9 h的表达量最高,达到2.0×105U/L,并持续表达至60h.

内含子数量改变GUS基因的瞬时表达调控

内含子是基因的重要组成部分,它与功能基因表达之间的关系越来越被重视。本研究以pCAM-BIA3301为载体,利用玉米泛素启动子Ubi1和水稻肌动蛋白启动子Actin1构建两个GUS基因表达载体p33U1和p33A1,同时设置3个对照载体。通过基因枪轰击法将上述载体转入水稻胚性愈伤组织,探讨内含子对外源目的基因表达的调控作用。组织化学检测结果表明:CaMV35S启动子调控下的iGUS(带内含子)基因能够顺利表达;同样,Actin1启动子(带内含子)调控下的不带内含子的GUS基因也可以正常表达,而当Actin1启动子(带内含子)驱动iGUS基因时,则导致GUS染色反应不能发生。Ubi1启动子(带内含子)调控GUS基因的瞬时表达也得出类似结果,证明表达框中内含子的数量为1个或两个时,对GUS基因的表达起到了不同的调控作用。本研究结果对植物表达载体构建及功能基因表达都具有指导意义。

AtDME1化学诱导表达载体的构建及其瞬时表达

以拟南芥去甲基化转移酶基因DME1为目的基因,采用酶切、连接和重组反应的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ER8-DME1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。q PCR结果表明,较低浓度的17-β-雌二醇处理能够有效调控p ER8-DME1中目的基因的表达,诱导处理后目的基因表达量逐渐升高,在12 h后达到最高,之后缓慢下降。该载体的成功构建为深入研究DNA去甲基化与植物的生殖发育调控奠定了基础。

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

【目的】以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体。【方法】采用PCR方法和基因枪法。【结果】用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段。然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达。采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色。【结论】构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础。

一种植物表达载体的构建及其在金柑上的瞬时表达

以植物表达载体pCambia1301的带内含子的GUS(iGUS)基因替换植物表达载体pBI121中的GUS基因,构建了以pBI121为基础载体并含有iGUS的植物表达载体pLZ13。农杆菌染色表明,pCamiba1301和pLZ13两载体中的iGUS基因均不会导致GUS染色反应。以金柑不同组织为材料,通过农杆菌介导开展瞬时表达研究,结果表明,pLZ13和pCambia1301两载体的iGUS在CaMV35S启动子调控下的表达没有差异,证明构建的pLZ13是一种同时适于瞬时表达和转基因研究的植物表达载体。

TBSV病毒瞬时表达载体构建及其表达

为了深入理解植物RNA病毒载体表达系统,初步建立了利用TBSV病毒表达载体在寄主植物烟草中表达外源蛋白的技术体系.以番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus,TBSV）为材料,构建了含报告基因sGFP的WY1,WY2等2个重组病毒表达载体,并将载体导入农杆菌GV3101用于侵染烟草植株叶片;利用农杆菌渗滤接种技术,使构建的载体在烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）中进行瞬时表达.结果表明,接种WY1的烟草,于接种后第2 d就可以检测到荧光信号,10~12 d时表达量达到最高.纯化后的sGFP与标准GFP相对分子质量相同且其荧光光谱也与文献报道的一致.对于感兴趣基因（Gene of interested,GOI）的表达和研究提供了一种新的途径.

利用病毒载体在烟草中瞬时表达融合HBsAg基因

利用马铃薯PVX病毒载体构建了外源人工融合乙肝表面抗原HBsAg基因的表达载体,在烟草中利用农杆菌介导进行瞬时表达,以快速鉴定外源基因瞬时表达的状况以及重组蛋白的免疫活性。利用PCR技术从含有人工融合HBsAg基因的表达载体中分别扩增出LP+PreS1+PreS2+S、PreS1+PreS2+S、PreS2+S序列,将其分别与PVX病毒载体pgR106连接,构建成PVX-LP、PVX-S1和PVX-S2等3个转化载体,并将此载体导入农杆菌菌株GV3101中用于侵染烟草植株叶片。感染植株经RT-PCR、RNA Dot blotting和HBsAg蛋白的ELISA检测显示,3个人工融合的HBsAg基因均可在植物体内得到转录,翻译成具有活性的蛋白。结果表明,外源融合HB-sAg基因经过植物病毒载体瞬时表达系统可以在植物系统中正常转录和翻译。

Rubisco小亚基基因片段的亚克隆及其瞬时表达载体的构建

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶位于植物叶绿体中,是绿色植物中含量最丰富的蛋白,它催化CO2固定和光呼吸作用的第一步。从含Rubisco小亚基基因片段的pGR107-rbcS质粒中亚克隆出Rubisco小亚基基因片段,将PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,用EcoRI酶切鉴定酶切重组载体,利用低溶点胶回收大约300bp大小的Rubisco小亚基基因片段,将其回收片段与pSLJ75515瞬时表达载体连接,用EcoRI酶切鉴定,筛选出阳性重组体,即为pSLJ75515-rbcS瞬时表达载体。本实验为进一步研究Rubisco小亚基基因功能和基因沉默机制奠定了基础。

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒 76 - 1 1 8株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体pTARGETTM,构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET -hans,并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法 ,将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGETM中 ;酶切鉴定 ;用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞 ;用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGETTM中 ;在部分转染重组质粒的Vero-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET -hans已被成功地构建并可在体外表达 。

雌二醇依赖性的细胞表达载体的研究

根据雌激素类化合物在机体内的作用机理,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因构建了4个启动子不同的表达载体(pERE-SV-EGFP,pERE-TA-EGFP,pERE-CMV-EGFP,pERE-TK-EGFP)。以这些表达载体瞬时转染MCF-7细胞,报告基因的基础表达与启动子的强度相关。以17β-雌二醇(E2,10-9mol·L-1)诱导表达载体瞬时转染的MCF-7细胞,发现在表达载体pERE-TA-EGFP、pERE-TK-EGFP、pERE-SV-EGFP转染的MCF-7细胞中,E2能诱导2倍以上的报告基因的表达。这表明在这些瞬时表达系统中报告基因的表达是雌激素依赖性的,因此这些表达载体可用于稳定转染以建立稳定表达分析系统。

三种乳腺特异表达载体表达特性的比较

为了比较不同来源乳腺特异表达载体的表达特性 ,将人溶菌酶 (hLYZ)cDNA分别克隆入自行构建的p2 0 5C3载体和国外引进的pBJ41和pBC1载体。重组载体p2 0 5C3LYZ、pBJLYZ和pBCLYZ分别用 2 5kDaPEI包裹后 ,通过尾静脉途径注射哺乳期小鼠。注射后 72h采集乳样 ,经微球菌溶解实验证明 ,3组小鼠乳汁中hLYZ的表达量分别为 87、69、60mg L ;从每组小鼠的 1 2种组织提取总RNA ,经Dotblotting检测证明 ,三种重组载体除在乳腺中表达外 ,p2 0 5C3LYZ还在小鼠的脾和肠、pBJLYZ在脾、pBCLYZ在脾和肾中具有一定的异位表达 ;在有hLYZmRNA转录的上述脏器中用微球菌溶解试验均可检测到hLYZ活性。这些实验结果表明 ,自行构建的乳腺特异表达载体的表达特性与从国外引进的表达载体无明显差别。

植物瞬时表达技术的主要方法与应用进展

瞬时表达技术是一种获得目的基因短暂的高水平表达的技术。与稳定表达相比,瞬时表达所需时间短,但因未将外源基因整合到宿主植物染色体中,不能稳定遗传给下一代。我们简要综述了植物瞬时表达技术的各种方法,介绍了各方法的原理、技术流程、影响因素及其应用。关于其应用,主要分析了生物制剂的合成、转录元件和转录因子的克隆与分析、基因沉默、亚细胞定位、蛋白互作分析、抑制子功能鉴定、选择性剪接调控、植物品种的改良和选育等方面。

可去除选择标记的DREB基因双T-DNA载体共转化玉米

通过体外重组构建双T-DNA双元载体pCDMARpWDT-Hyg,选择标记基因hpt(hygromycin phospho-transferase)和抗逆转录因子基因DREB分别位于两个独立的T-DNA。用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过在抗性培养基上严格筛选,在获得的再生转化植株中,同时整合hpt基因和DREB基因的共转化率达到26·3%。该转化系统的建立为下一步得到无选择标记的转基因植株奠定基础。此外,本实验还通过gus基因的瞬时表达分析了农杆菌转化玉米的影响因素。

eGfp/Gus融合基因植物表达载体的构建和转化验证

绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增增强型Gfp(eGfp)和Gus基因,连接到植物表达载体pF-GC5941中,构建含CaMV35S启动子驱动的eGfp/Gus基因融合表达载体,命名为pFGC-DR。注射农杆菌法转化烟草叶片,以及花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥,发现融合基因成功地在烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥中稳定表达,表明融合报告基因在烟草和拟南芥中都能高效表达。