基于RNAi的生物农药研究进展

化学农药的大量使用产生的病虫害抗性、环境污染和农产品安全等一系列问题,使得新型可持续的植物保护策略成为农业绿色发展的必然要求。近年来,RNAi在植物病虫害防控中的应用潜力得到越来越多的关注,基于RNAi的生物农药(即核酸农药)的研发越来越迅速。核酸农药以喷雾诱导基因沉默(SIGS)为基础,通过外源施用针对靶标病原菌或害虫的dsRNA,即可触发RNAi从而抑制病原菌或害虫,实现对靶标病虫害特异性控制。由于核酸农药具靶标特异性、环境友好、不易产生抗性等优势,相关研究和开发进程日益加快,使之有望成为化学农药的重要补充或替代。文章对核酸农药的作用机制、研究进展、产品研发和应用现状,在商业化和使用过程中的风险以及需要注意的问题进行了综述,以期为相关研究提供参考。

甜菜BvPCNA基因RNAi载体构建

【目的】增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在植物中广泛存在,但是其在植物中的功能研究较少。本研究可以为BvPCNA-like基因的功能分析奠定基础。【方法】课题组前期在甜菜基因组中克隆获得一个基因位点,命名为BvPCNA-like基因,本研究以BvPCNA-like基因的克隆载体为初始材料,选取适宜的靶序列,利用植物表达载体pFGC5941作为基础载体,使靶序列上游启动子为35 S,植物筛选标记为抗除草剂基因BlpR,设计靶序列特异性引物,采取PCR-酶切-连接方法,构建BvPCNA-RNAi载体。【结果】通过RCR鉴定表明已获得了预期目标载体,插入片段由正向靶序列BvPCNA-F、中间片段、反向靶序列BvPCNA-R组成,靶序列长度为320 bp。【结论】本研究所得载体适用于对双子叶植物进行遗传转化,可以作为BvPCNA-like基因理论研究或应用研究的载体材料。

RNAi技术在烟粉虱基因功能和防控研究中的应用

烟粉虱(Bemisia tabaci)是一种世界性蔬菜害虫,可传播多种植物病毒,影响植物生长发育,导致蔬菜产量下降。烟粉虱的防治以化学防治为主,但过度使用杀虫剂导致烟粉虱的抗药性不断增强,绿色防控的需求日益增加。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一项特异性沉默靶标基因技术,广泛应用于昆虫的基因功能研究和绿色防控。通过介绍RNAi作用原理和RNAi在烟粉虱的基因功能,总结了RNAi在烟粉虱的防控应用和RNA农药的应用现状,为烟粉虱的新靶点研究和开发RNA农药进行烟粉虱防控应用提供参考。

LINK-A RNAi慢病毒载体构建及其抑制U251胶质瘤细胞增殖的研究

目的构建lncRNA LINK-A的特异性RNAi慢病毒载体,并借此敲减人U251胶质瘤细胞株内的LINK-A,探究LINK-A对U251胶质瘤细胞增殖的影响。方法针对人LINK-A设计siRNA序列,构建RNAi慢病毒载体质粒并进行测序鉴定;利用pHelper 1.0、pHelper 2.0以及shRNAi 3种质粒分别转染293T细胞,筛选分离慢病毒并测定滴度;用PBS及构建好的慢病毒感染人U251胶质瘤细胞,实验分3组:空白组(PBS)、NC组(空载病毒)、LINK-A(-)组(LINK-A RNAi慢病毒),72 h后利用RT-PCR检测细胞中LINK-A的表达情况;取病毒感染成功后的U251胶质瘤细胞行平板克隆实验培养10 d,行CCK-8实验分别于24 h、48 h检测。结果RNAi慢病毒载体质粒测序结果与RNAi设计序列一致,提示LINK-A RNAi慢病毒载体构建成功,滴度为3×108 TU/mL;病毒感染U251胶质瘤细胞72h后,细胞生长状态良好,荧光持续稳定表达,LINK-A RNA相对表达量明显降低(P<0.05),表明病毒成功感染U251细胞;10 d后LINK-A(-)组细胞克隆形成数及形成率较空白组及NC组明显减少(P<0.05);与空白组及NC组相比,24 h后LINK-A(-)组OD值减少(P<0.05),72 h明显减少(P<0.05)。结论人LINK-A RNAi慢病毒构建成功;LINK-A表达降低可抑制U251胶质瘤细胞增殖。

Split-GFP双分子荧光互补技术在鸡MSTN基因RNAi检测中的应用

【目的】以Split-GFP双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因(MSTN)RNA干涉(RNAi)效果,并与其他常用检测方法比较,以验证Split-GFP双分子荧光互补技术在RNAi效果评估中的有效性和可行性。【方法】将合成的3个shRNA慢病毒载体(shRNA-a、shRNA-b和shRNA-c)分别转染稳定表达GFP11-MSTN融合蛋白的HEK 293TGFP11-MSTN细胞,经实时荧光定量PCR筛选出最佳shRNA慢病毒载体并包装为慢病毒,然后以慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞,采用潮霉素B筛选mCherry阳性(mCherry+)细胞,再以实时荧光定量PCR和Western blotting检测RNAi效果;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,通过荧光显微镜观察和流式细胞术评估RNAi效果。【结果】3个shRNA慢病毒载体对MSTN基因表达均有极显著的抑制作用(P<0.01,下同),其中又以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒载体的干涉效果最佳。Anti-MSTN shRNA-a慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞的最适MOI=3,该条件下MSTN基因相对表达量及GFP11-MSTN融合蛋白表达量均受到抑制;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,荧光显微镜观察和流式细胞术检测结果表明,GFP+细胞数量明显减少,GFP+细胞百分率由31.1%降至11.5%。Split-GFP检测结果与实时荧光定量PCR及Western blotting检测结果相符,说明Anti-MSTN shRNA-a慢病毒能有效抑制GFP11-MSTN融合蛋白表达,发挥了RNAi作用。【结论】以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒对MSTN基因的干涉效果最佳,其感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞后MSTN基因表达极显著下调,且再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒后细胞中的GFP+细胞百分率明显下降,与实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果相符,证实Slipt-GFP双分子荧光互补技术是一种可靠的可视化RNAi检测方法。

对PKM2进行RNAi可提高环磷酰胺对PC3细胞的抑制作用

目的目的:探讨对丙酮酸激酶同工酶(PK)M2进行RNAi提高环磷酰胺(CTX)对PC3细胞的抑制作用。方法通过联合CTX和表达PKM2的短发夹RNA(shRNA)质粒用于人PC3细胞株,观察其对PC3细胞生长的影响。结果pshRNA-Con组细胞增殖率明显高于其他3组,pshRNA-PKM2+CTX组细胞增殖率明显低于pshRNA-PKM2组和CTX组(均P<0.05)。pshRNA-PKM2组和CTX组细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。pshRNA-PKM2+CTX组细胞凋亡率明显高于其他3组(均P<0.05)。第18天后,pshRNA-Con组同一时间点肿瘤体积均明显高于其他3组,pshRNA-PKM2+CTX组同一时间点肿瘤体积均明显低于其他3组(均P<0.05)。结论PKM2是调节肿瘤细胞有氧糖酵解的关键酶,抑制PKM2可抑制肿瘤生长。

家蚕RNAi效率相关核酸酶基因对RNAi效率的影响

【目的】鳞翅目(Lepidoptera)昆虫消化系统存在的核酸酶是导致RNAi低效的主要原因之一,本研究旨在探索家蚕Bombyx mori RNAi效率相关核酸酶(RNAi efficiency-related nuclease, REase)BmREase对家蚕RNAi低效的影响。【方法】利用RT-PCR对家蚕BmREase cDNA全长序列进行同源克隆和生物信息学分析,并采用最大似然法进行系统发育分析;利用qRT-PCR检测BmREase在游走期家蚕不同组织(头、表皮、脂肪体、中肠、气管、马氏管和丝腺)中的特异性表达。通过向游走期家蚕注射BmREase,家蚕蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)基因BmEcR,超气门蛋白(ultraspiracle, USP)基因BmUSP和细胞因子sp?tzle1(BmSpz1)基因BmSpz1的dsRNA进行RNAi,分析干扰BmREase表达后是否可以提高靶基因dsRNAs的干扰效率。【结果】RT-PCR扩增得到家蚕BmREase(GenBank登录号:XM_021350017.2)全长cDNA序列,其ORF长2 241 bp,编码746个氨基酸残基;生物信息学分析发现,BmREase与人核酸外切酶I 3qe9.1具有极其相似的结构,其Thr7, His33, Ala37, Arg93, Lys97, Tyr159, Asp160, Ser161和Asn174组成的活性结构域能够与核苷酸序列结合,暗示BmREase具有核酸酶活性。qRT-PCR结果显示,BmREase在家蚕游走期的中肠和马氏管中高表达,说明BmREase主要在家蚕消化系统中表达。在家蚕游走期注射dsRNA,BmREase的表达量比空白对照组的高,RNAi干扰BmREase提高了dsBmEcR, dsBmUSP和dsBmSpz1的干扰效率。【结论】家蚕体内存在与人类核酸外切酶相似功能的酶BmREase,其存在可能影响dsRNA在家蚕体内的干扰效果。本研究为利用RNAi进行家蚕基因功能的研究以及进一步开发RNAi防治害虫具有指导性意义。

RNAi介导的HvCDA1基因沉默影响茄二十八星瓢虫存活和发育

【目的】茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata是茄科(Solanaceae)植物上的重要害虫。昆虫体内几丁质脱乙酰酶1(chitin deacetylase 1,CDA1)催化N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺脱去乙酰基,促使几丁质转化为壳聚糖,控制昆虫体内几丁质纤维有序堆积,并维持角质层结构的完整性。抑制虫体中CDA1基因的表达会抑制壳聚糖的合成,影响昆虫表皮结构的形成,使昆虫不能正常发育而亡。【方法】利用RT-qPCR方法测定HvCDA 1基因在茄二十八星瓢虫不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫和预蛹)和4龄幼虫不同组织(表皮、脂肪体、中肠和马氏管)中的表达模式。通过饲喂茄二十八星瓢虫1龄幼虫不同浓度ds HvCDA1溶液浸泡处理1 min的茄子叶片后及直接饲喂4龄幼虫不同浓度ds HvCDA1溶液,探究沉默茄二十八星瓢虫HvCDA1基因对其幼虫存活和发育以及HvCDA1基因表达量的影响。【结果】发育表达谱结果表明,HvCDA1在茄二十八星瓢虫的各发育阶段均有表达,但在1龄末和2龄末幼虫中的表达量最高。组织表达谱结果显示,在茄二十八星瓢虫4龄幼虫的表皮中HvCDA1基因的表达量显著的高于其他组织中的。1龄幼虫取食50 ng/μL ds HvCDA1溶液浸泡处理的茄子叶片后,幼虫蜕皮后其枝刺不能直立,角质层不能正常形成,且出现取食障碍直至死亡;饲喂50,200和400 ng/μL ds HvCDA1溶液浸泡处理的茄子叶片后48 h时,死亡率分别高达84%,94%和100%。与对照组(饲喂ds GFP溶液浸泡处理的茄子叶片)相比,饲喂1龄幼虫50 ng/μL ds HvCDA 1溶液浸泡处理的茄子叶片后48和96 h时,其HvCDA1基因的表达量分别下降了38.63%和79.00%。另外,4龄幼虫单头饲喂50,200和400 ng ds HvCDA1溶液,可分别导致29%,40%和66%的幼虫化蛹后呈畸形且不能正常羽化。与对照组(饲喂200 ng/头ds GFP溶液)相比,饲喂4龄幼虫200 ng/头ds HvCDA1溶液后48和96 h时,其HvCDA1基因的表达量分别下降了52.99%和70.09%。【结论】上述结果表明,HvCDA1基因在茄二十八星瓢虫的存活和发育中起重要作用。当该基因表达受阻,会负面影响茄二十八星瓢虫的蜕皮、化蛹以及羽化,最终死亡。本研究结果表明HvCDA1可作为1个潜在的防治二十八星瓢虫的RNAi靶标基因。

RNAi技术在昆虫基因组学研究及其生物防控中的研究进展

RNAi技术是通过将双链RNA(dsRNA)导入宿主细胞,沉默相关基因进而干扰宿主生长发育的一项技术,广泛应用于昆虫的生物防控。近年来,基于RNAi开展昆虫的防控技术研究中发现RNAi的效率受到多方面因素的影响,其中dsRNA的导入途径是关键的影响因素。本文总结了显微注射法、电穿孔介导法、饲喂法、转基因法、纳米载体介导法等5种方法在昆虫的基因组学研究和RNAi生物防控中的应用效果,比较了不同方案的优缺点,以期为昆虫的RNAi应用研究和生物防控技术提供参考。

水稻OsBAK1P基因过表达与RNAi载体构建及其表型鉴定

为了探究水稻油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1前体物质OsBAK1P对水稻相关农艺性状的影响。通过以中花11粳稻品种为材料,根据基因所设计的特异性引物从水稻穗部cDNA中扩增得到CDS片段大小为651 bp的目的序列片段;通过酶切酶连的方法成功构建了PTCK303-OsBAK1P过表达载体和PTCK303-OsBAK1P RNA干扰载体;用农杆菌EHA105菌株转化表达正确的载体质粒并利用基因CDS扩增引物检测菌落筛选出阳性农杆菌克隆;再利用农杆菌遗传转化法侵染中花11粳稻品种的愈伤组织从而获得转基因植株;最后,相比较于中花11挑选2个表型相似的过表达、RNA干扰的T1转基因植株测定并分析株高、穗长、叶夹角等农艺性状的变化和萌发初期的根长、胚芽鞘长度的变化以及对芸苔甾内酯(BL)的响应程度。结果表明,OE-OsBAK1P转基因水稻植株株高矮化,穗长变短,叶片夹角下降,种子萌发后根长增长而幼苗长度缩短,叶片对BL的响应不敏感;而RNAi-OsBAK1P转基因水稻植株株高增加,穗长变长,叶片夹角增加,种子萌发后根长缩短而幼苗长度增长,叶片对BL的响应敏感。综上,这些结果为改变水稻植株结构进而增加籽粒产量提供理论支持并可能为后续研究OsBAK1和前体物质OsBAK1P的其他功能提供参考。

RNAi技术在寄生蜂中的应用研究进展

RNA干扰技术问世至今20余年,已被广泛用于基因功能研究。膜翅目寄生蜂是农林害虫防治领域重要的天敌昆虫资源。RNAi技术对靶基因的昆虫沉默效果依赖于dsRNA的递送效率。寄生蜂幼期通过摄取寄主昆虫营养完成其生长发育,并与寄主昆虫发生相互作用,给RNAi技术的实施带来挑战。目前,RNAi技术已在丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)、中红侧沟茧蜂(Microplitis mediator)、菜蛾盘绒茧蜂(Cotesia vestalis)、蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)、斑痣悬茧蜂(Meteorus pulchricornis)等至少13种寄生蜂中开展。本文归纳了RNAi技术在寄生蜂基因调控方面的研究进展,并总结了在寄生蜂类群中影响RNAi效率的因素,以期为RNAi技术在寄生蜂类群中的应用提供参考。

马铃薯RPP13基因RNAi载体的构建及遗传转化

RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析,发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关,应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析,选取其共同的保守区域作为沉默对象,构建了以该保守区域为臂,马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中,应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红,以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料,经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽,将再生植株进行PCR检测,筛选得到3株阳性转基因植株;以马铃薯的ef1a基因作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明:所获得的3株转基因植株中RPP13基因的表达量与未转基因的对照相比具有显著差异,在所获得的RNAi转基因马铃薯植株中,RPP13基因表达量的降低幅度为35%~60%。

温度对Mhc>PINK1-RNAi转基因帕金森果蝇模型的影响

目的 探讨温度对Mhc>PINK1-RNAi转基因帕金森(PD)果蝇模型的影响。方法 首先,将2个黑腹果蝇Drosophilamelanogaster品系UAS-PINK1-RNAi和Mhc-GAL4杂交获得Mhc>PINK1-RNAi转基因PD果蝇,以w1118作为对照组,将两组果蝇放置在不同的温度(25℃和29℃)下培养。然后采用逆转录定量PCR(reverse transcription quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测果蝇体内靶基因PINK1的表达水平。最后结合攀爬指数、体视显微镜下观察异翅率等行为学指标以及酶联免疫技术检测多巴胺含量(DA)等指标来评价Mhc>PINK1-RNAi转基因PD果蝇模型。结果 在25℃培养条件下,与w1118相比,Mhc>PINK1-RNAi转基因PD果蝇PINK1基因表达量下降,且表现出典型的PD症状:多巴胺含量、攀爬能力显著下降和异翅率显著提高(P<0.05)。在29℃培养条件下,与w1118相比,Mhc>PINK1-RNAi转基因PD果蝇PINK1基因没有沉默、多巴胺含量差异无统计学意义(P>0.05),异翅率显著提高(P<0.05)。与25℃培养条件相比,29℃培养条件下,10 d和20 d Mhc>PINK1-RNAi转基因PD果蝇异翅率较低,仅为4.6%和8.2%。结论 Mhc>PINK1-RNAi转基因PD果蝇在常温25℃培养条件下模型成立。

青狗尾草RNAi途径相关基因的全基因组鉴定和表达分析

RNAi途径是RdDM途径的衍生途径,其中的AGO、DCL和RDR蛋白在植物的生长发育和响应非生物/生物胁迫过程中发挥重要作用。为了研究RNAi途径的3种主要蛋白在青狗尾草中的序列及结构特征,利用比较基因组学方法,在青狗尾草中鉴定到13个AGO基因、7个DCL基因和4个RDR基因,并对其蛋白质亚细胞定位、系统发育关系、保守结构域进行预测。同时,利用转录组数据分析RNAi途径的3类相关基因在青狗尾草的16种不同生长时期、不同生长条件下的表达模式。蛋白质结构域分析发现,SvDCL3b和SvRDR3缺少重要的结构域。转录组分析发现,SvAGO1b、SvDCL1a和SvRDR1在各家族中表达量较高,可能在RNAi途径中发挥主要作用,且大多数青狗尾草和谷子的同源基因间的表达模式基本一致。综上,本研究为理解RNAi途径的3种主要基因在调控青狗尾草的表观遗传修饰中的功能和作用提供初步的理论依据,为青狗尾草和谷子之间驯化的分子机制提供参考。

植物非细胞自主性RNAi及其应用研究进展

非细胞自主性RNAi是发生于那些非应用或非产生dsRNA的细胞或组织中的RNAi,包括系统性RNAi和环境RNAi。系统性RNAi是沉默现象从一个细胞扩散到另一个细胞或从一个组织扩散到另一个组织的过程,环境RNAi是细胞从环境中吸收dsRNA而触发的RNAi。近年来,植物非细胞自主性RNAi研究取得了较大进展,就其机制及应用进行了评述,首次提出在植物中也有环境RNAi存在。

长枝木霉聚合根肿菌多元RNAi靶标防治榨菜根肿病的研究

榨菜根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起的一种土传性病害,在榨菜栽培过程中危害十分严重。研究构建了丝状真菌表达根肿菌3个MAPK基因的dsRNA载体,利用PEG介导的原生质体转化技术将dsRNA载体转化到对榨菜根肿病具有生防作用的长枝木霉菌株中,通过抗生素筛选和PCR鉴定筛选到阳性转化子(即转基因长枝木霉),并对3个MAPK基因dsRNA在转基因长枝木霉中的表达情况进行了检测,分析了转基因长枝木霉对榨菜根肿病的防治效果。结果表明:通过RNAi技术对该长枝木霉菌株中多个MAPK基因进行联合干扰,可增强长枝木霉对根肿病病原菌的抗性,显著抑制根肿菌中3个MAPK基因的表达,从而提高长枝木霉对榨菜根肿病的防效,降低榨菜根肿病的病情指数。该研究结果可为根肿病防治提供新的思路。

RNAi在药物研究中的研究进展

RNA干扰是双链RNA分子在mRNA水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默。随着RNAi分子机制研究的深入和应用的发展,RNAi已经应用在药物研究的各个领域,特别在药物开发上能够解决一些如药物靶点的鉴定、优化药靶等瓶颈问题,在节约研发时间的同时加速药物的临床研究。RNAi是药物研究的领域具有很大潜力的新型技术工具。

狗头枣ACOⅠ基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

枣作为我国一种独特的优势经济作物,既可鲜食也可制成枣干,其营养价值高,经济效益好,而采摘后易软化变质影响销售。为探索ACOⅠ基因功能及其与枣果软化之间的关系,以狗头枣ACOⅠ基因外显子3和外显子4为靶标,构建了以CaMV 35S启动子驱动的ihRNAi植物表达载体pART ACOⅠ_(3-4)。以ZK木枣品系叶片为外植体,采用农杆菌介导的叶盘法法对其进行遗传转化,经抗性筛选及PCR鉴定,初步获得了16株阳性木枣试管苗。通过木枣叶片为外植体对其进行遗传转化获得转基因材料,为培育出耐贮藏的转基因红枣奠定基础。

RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展

文章主要综述了RNA干涉(RNAi)技术在植物功能基因组学中的研究策略及研究现状,包括RNA干涉的作用机制及技术特征,引发植物RNAi机制的转基因RNAi技术以及病毒介导的基因沉默技术。转基因RNAi技术方面,包括载体结构的优化策略、高通量载体的构建方法以及该技术的优缺点。病毒介导的基因沉默技术方面包括病毒载体及宿主种类,病毒感染方法,试验对照的建立、环境因素的影响以及该技术的优缺点。

蓖麻毒蛋白A链基因RNAi转化研究

通过基因沉默技术调控蓖麻毒蛋白A链基因的表达,以期获得低毒蓖麻新材料。利用基因克隆技术获得蓖麻毒蛋白A链基因762bp片段,命名为RTA基因。进一步利用该基因构建了植物RNAi表达载体pBI-RTA-S-AS,通过农杆菌介导法转化蓖麻子叶节,用卡那抗性筛选转化再生植株,PCR进一步鉴定转基因植株。结果表明:克隆得到目的基因长762bp,与预期结果一致;卡那抗性筛选和PCR鉴定结果显示,获得了3株转基因阳性植株。