CRISPR/Cas9系统RNP体内递送的挑战与解决策略

目的针对体内递送CRISPR/Cas9核酸蛋白复合物(ribonucleoprotein complex,RNP)面临的包封效率低,细胞靶向性差,体内滞留时间短,存在脱靶效应等多种挑战,综述应对方案和研究进展。方法查阅国内外相关文献,对现有递送RNP的载体进行整理,分析其优劣并归类。结果从构建合适的递送载体和探索合理的改造方法两方面提供RNP体内递送问题的解决方案。结论递送RNP实现CRISPR/Cas9系统的基因编辑是一种直接有效的方法,通过RNP体内递送问题的解决方案,有助于RNP在体内发挥更高效精准的基因编辑作用。

应用Cas9 RNPs进行绵羊FecB基因型检测的可行性研究

为了研究Cas9 RNPs用于绵羊FecB基因分型的可行性,试验以FecB基因BB、B+、++型的绵羊个体为试验动物提取基因组DNA。基于Cas9 RNPs的体外DNA定点内切酶活性,用FecB基因靶位点的特异性引物扩增产物作为底物,利用大肠杆菌共表达纯化获得Cas9 RNPs,对不同FecB基因型目标样本进行酶切检测。结果表明:SDS-PAGE电泳结果显示,在130~180 kD之间有一条与预期大小相符的特异蛋白条带;3种基因型的靶DNA均被切割为185 bp和368 bp两个片段;绵羊FecB++型成纤维细胞Cas9 RNPs电转染的突变检测结果显示,纯化的两个Cas9 RNPs都具有基因组编辑活性。说明本研究获得的Cas9 RNPs在体外和细胞内都具有良好的酶活性,但未能区分绵羊FecB基因型。

载Cas9-RNP细胞膜囊泡仿生纳米粒的制备及其对小鼠巨噬细胞NLRP3基因的敲低作用

目的通过使用小鼠巨噬细胞膜包裹Cas9核糖核蛋白复合物(RNP),制备Cas9-RNP仿生纳米粒Cas9-RNP@MMs,旨在利用此仿生纳米粒递送Cas9-RNP复合物用于基因编辑,并进一步在体外研究小鼠巨噬细胞RAW264.7对Cas9-RNP@MMs的内吞情况及其基因编辑效果,为开发低毒性的抑制NLRP3治疗靶点的仿生纳米粒载体提供证据。方法将提取的小鼠巨噬细胞细胞膜与制备的Cas9-RNP混合,超声后使用脂质体挤压仪挤压得到Cas9-RNP@MMs。使用纳米颗粒跟踪仪检测Cas9-RNP@MMs的颗粒直径,透射电子显微镜下观察Cas9-RNP@MMs的颗粒形态。激光共聚焦荧光显微镜成像分析细胞对Cas9-RNP@MMs的内吞情况。采用MTT法检测Cas9-RNP@MMs生物相容性。通过qPCR和Western blot检测NLRP3表达,来验证Cas9-RNP@MMs敲低NLRP3基因的效果。结果采用巨噬细胞细胞膜制备的Cas9-RNP@MMs平均粒径约为216 nm;激光共聚焦荧光显微镜下,Cas9-RNP@MMs能成功被RAW246.7细胞摄取;MTT检测结果显示Cas9-RNP@MMs处理的小鼠巨噬细胞RAW246.7具有良好的生物相容性;qPCR和Western blot检测显示,有两条NLRP3特异的向导RNA(sgRNA)通过Cas9-RNP@MMs介导,有良好的敲低NLRP3基因表达的效果。结论利用仿生纳米粒成功制备了内腔载有Cas9-RNP复合物的纳米级囊泡Cas9-RNP@MMs,Cas9-RNP@MMs具有良好的生物相容性并且可以被RAW246.7细胞高效内吞;含有NLRP3特异的sgRNA的Cas9-RNP@MMs能够特异性敲低NLRP3基因表达。

基于RNP AR飞行程序运行的效益性研究

随着RNP AR程序在中国民航的成熟运用,RNP AR正成为提高运行安全裕度、提升公司运行效益的重要方法,结合国内某机场未来的RNP AR运行情况,比对RNAV与RNP AR程序的航迹距离、下降剖面,对航空器运行进行燃油消耗模拟,对RNP AR飞行程序在不同占有率下,通过分析时间成本与燃油成本,得出航空公司在实施RNP AR运行的效益。

RNP抗原及其抗体

U1RNP抗原是可提取性抗原组成之一,与抗U1RNP抗体反应的主要是U1RNP中的3种多肽:U1-70K、U1A和U1C。目前认为抗RNP抗体是MCTD的标志性抗体。本文将主要介绍RNP抗原的组成、生物学功能和抗原性,以及抗RNP抗体与临床的相关性。

聚乳酸/聚乙醇酸可生物降解微球的制备及其对RNP的佐剂作用

目的 制备包裹狂犬病毒核衣壳 (RNP)的PLA/PLG可生物降解微球 ,并观察其对RNP的佐剂作用。方法 以蛋白载量、包裹率、微球形态及粒径分布作为评价微球质量的指标 ,通过变换制备条件 ,获取质量较好的微球 ;观察三种不同聚合物材料制成的RNP微球在体外 37℃条件下的水解和释放 ;比较不同微球免疫效果。结果 PLA/PLG微球作为RNP载体 ,单剂接种诱生实验动物的抗NP抗体与AL(OH) 3 佐剂两次接种的滴度接近 ,但明显好于不加佐剂的对照组。结论 PLA/PLG微球对RNP具有良好的佐剂作用。

基于World Wind的RNP飞行程序三维可视化仿真

针对所需导航性能(RNP)飞行程序的虚拟现实验证问题,结合RNP飞行程序的特点重点解析了航线及RNP隧道的结构和计算方法。利用World Wind三维地理信息系统的二次开发功能,提出了一种RNP飞行程序三维可视化及模拟飞行的方法,实现了高分辨率地理环境下飞行航迹、包容区隧道的三维可视化及动态的模拟飞行。最后利用该方法对典型的RNP飞行程序进行了仿真,结果表明该方法能够方便快速地完成RNP飞行程序三维仿真,可用于RNP飞行程序的设计及验证。

抗U_1RNP抗体在系统性硬化症中的临床意义

目的分析抗U_1RNP抗体与中国系统性硬化症（systemic sclerosis,SSc）患者临床特征及实验室指标的相关性。方法选取上海中西医结合医院、河北以岭医院、成都中医药大学附属医院和中南大学湘雅二医院等4家医院诊断明确的中国SSc患者354例,记录其临床表现和实验室检查结果,同时检测抗U_1RNP、ATA、ACA、SSA、SSB、Sm抗体。统计分析抗U_1RNP抗体阳性患者与阴性患者之间各种临床特征及实验室指标。结果 354例SSc患者中抗U_1RNP抗体的阳性率为25.5%,抗U_1RNP抗体阳性组患者发病年龄为（35.38±12.45）岁,明显低于抗U_1RNP抗体阴性组患者的（39.80±12.81）岁（P〈0.01）。在多因素分析中,抗U_1RNP抗体阳性者较阴性者关节肌肉累及发生率增加,手指点状凹陷症状发生率降低,C3水平降低,白细胞和血小板计数减少,但IgG水平和C3降低发生率明显增高（P〈0.05）。分层分析中,与抗U_1RNP抗体阴性患者相比,阳性组中女性患者不易发生活动后气促症状,而在40-50岁发病的抗U_1RNP抗体阳性患者不易患有消化道累及的症状,病程在12年以上的SSc患者具有较低的皮肤硬度积分（P〈0.05）。抗U_1RNP抗体阳性的SSc患者具有更高的抗Sm、SSA、SSB抗体检出率,而阴性SSc患者有更高的ATA抗体检出率（P〈0.05）。与ATA抗体阳性者比较发现,抗U_1RNP抗体阳性患者仍具有很低的手指点状凹陷症状的发生率（P〈0.05）。结论抗U_1RNP抗体是中国SSc患者的常见自身抗体,与ATA、Sm、SSA、SSB抗体联合检测有助于提高SSc的诊断,U_1RNP抗体阳性的SSc患者应密切关注关节肌肉累及和血液系统的变化,男性患者应注意高密度胆固醇水平的变化。抗U_1RNP抗体阳性患者的SSc严重程度不如ATA阳性的患者,此类患者不易患有手指点状凹陷症状,女性患者不易发生活动后气促,40-50岁发病患者不易累及消化道。

成都-拉萨所需导航性能(RNP4)平行航路安全性评估研究

根据中国民航基于性能导航(PBN)实施路线图,2017年后,PBN航路将达到100%。目前,成都-拉萨RNP4平行航路正在协调实施。对成都-拉萨RNP4平行航路的安全评估进行了研究。首先运用改进的REICH模型介绍了平行航路碰撞风险的计算方法。其次,分析了侧向重叠概率的计算方法。侧向重叠概率由一般偏航和大偏航两部分组成。有别于之前的研究,采用更接近于实际运行现状的分离的双指数分布来描述大偏航密度函数。最后对成都-拉萨RNP4平行航路的碰撞风险进行了评估。评估结果满足安全目标水平的要求,也表明该方法是可行的。

家蚕CDK11与RNPS1和9G8相互作用的鉴定

【目的】鉴定家蚕(Bombyx mori)CDK11与RNPS1和9G8的相互作用,为解析其是否参与前体RNA的剪接打下基础。【方法】利用家蚕基因组数据库Silk DB找到本研究克隆的家蚕基因序列,采用Primer 5.0进行引物设计,通过PCR技术克隆获得家蚕的两个重要剪接因子RNPS1和9G8,并构建具有不同抗原标签的过表达载体,采用NCBI检索并获得其他物种的相关序列,利用在线预测软件SMART进行结构域预测,采用Clustal X 1.83和GENEDOC 3.2预测同源序列,利用软件MEGA 6.0构建系统进化树,通过免疫荧光验证家蚕CDK11两种剪切体CDK11A和CDK11B分别与RNPS1和9G8的共定位情况,进一步通过免疫共沉淀验证CDK11A、CDK11B分别与RNPS1和9G8的相互作用。【结果】RNPS1的开放阅读框长为882 bp,编码293个氨基酸;9G8的开放阅读框长为531 bp,编码176个氨基酸;RNPS1和9G8都属于SR蛋白家族,具有该蛋白家族成员的一个富含丝氨酸/精氨酸(S/R)重复序列的RS结构域。同源序列比对表明,RNPS1和9G8都具有典型的RRM结构域,此外9G8还含有一个锌指结构域。系统进化分析显示,RNPS1聚类于无脊椎动物一支,与同为鳞翅目昆虫的斑点木蝶、黑脉金斑蝶等亲缘关系较近;9G8也聚类于无脊椎动物一支,与同为鳞翅目昆虫的黑脉金斑蝶、金凤蝶等关系较近。荧光共定位证明,RNPS1分别与CDK11A和CDK11B共定位于细胞核中,且具有点状共聚集现象;同时发现,RNPS1还具有胞质定位,点状聚集于核外周。而9G8分别与CDK11A、CDK11B在细胞核中也具有共定位现象。进一步通过免疫共沉淀发现,在所有的总蛋白和细胞裂解离心后的上清液样品中,均能检测到对应目的条带的表达,表明共转染的细胞均能正常表达目的蛋白,并且蛋白溶于上清。同时,在所有的共沉淀条带中,均能检测到对应目的条带,以上结果表明CDK11A、CDK11B均与RNPS1和9G8具有相互作用。【结论】家蚕RNPS1和9G8具有典型的RRM结构域,属于SR家族。CDK11A和CDK11B能够与RNPS1和9G8相互作用。

hnRNP A1的功能研究进展

核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)是一类多功能RNA结合蛋白家族,能与RNA聚合酶Ⅱ合成的新生转录本结合,并以复合体形式参与转录本稳定与成熟调控过程.hnRNP A1是hnRNPs家族重要成员,不仅广泛参与癌症与神经系统疾病相关基因的可变剪接调控,还在病毒侵染、细胞衰老及应激恢复中发挥重要作用.此外,hnRNP A1作为典型的RNA结合蛋白,在转录与可变剪接调控过程中,可通过动态三维结构识别特定序列.本文总结了hnRNP A1的最新研究进展,以期为进一步探究hnRNP A1在疾病发生中的功能研究提供参考.

SLE患者抗U1RNP抗体与HLA-Ⅱ类基因的相关性分析

目的 探讨云南汉族系统性红斑狼疮 (SLE)患者抗U 1RNP抗体与HLA DRB1、DQA1、DQB1等位基因及单体型的相关性。方法 采用多聚酶链反应 序列特异性引物 (PCR SSP)技术对 63例云南汉族SLE患者进行DRB1、DQA1、DQB1基因分型。结果 抗U1RNP抗体阳性的SLE病人中DQA1 0 10 1及DR15 DQA1 0 10 2 DQB1 0 60 1单体型频率亦显著增高 (P =0 .0 40 ,P =0 .0 0 0 )。结论 云南汉族SLE抗U 1RNP抗体的产生与DQA1 0 10 1等位基因及DR15 DQA1 0 10 2 DQB1 0 60

同时检测抗SSA和抗RNP在诊断结缔组织病中的意义

目的探讨抗SSA和抗RNP在结缔组织病中出现的机率。方法采用双免疫扩散法(ID)和免疫印迹法(IBT)同时检测抗SSA和抗RNP。结果用ID法检测系统性红斑狼疮(SLE)患者抗SSA阳性率远高于抗RNP(P<0.05),混合性结缔组织病患者中抗RNP阳性率l00%高于抗SSA的19%(P<0.001),结缔组织病患者中抗SSA阳性率82.8%亦远高于抗RNP的14.1%(P<0.05)。结论ID法比IBT法检测抗SSA较全面,使用ID法和IBT法同时检测抗SSA和抗RNP,可以提高临床诊断的正确性,减少漏诊。

基于RNP的DR/GPS/DME/VOR综合导航及性能评估方法

为提高民用飞机的综合导航性能,确保RNP运行的安全性,提出了一种基于DR/GPS/VOR/DME的机载综合导航系统及实际导航性能评估方法。考虑多传感器导航系统的误差特性,建立了系统误差模型,采用残差χ2检测方法构建系统量测模型,基于序贯处理的平方根滤波方法实现位置的最佳估计,并基于位置协方差阵实现ANP的实时评估。仿真结果表明:综合导航系统能够实现位置的精确估计,ANP算法能够在95%时间内评估导航系统实时误差特性,具有较高的评估精度,满足RNP运行要求。

关于RNP和SCS的若干等价条件

用切片方法 ,讨论了 Banach空间中有界闭凸子集的 RNP和 SCS的若干等价条件 .

人自身抗原U1RNP 70K的酵母重组分泌表达及斑点免疫金渗滤检测法的建立

目的人自身抗原U1RNP 70K通常采用组织提取法或原核表达获得。文中用基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人U1RNP 70K自身抗原,并建立斑点免疫金渗滤检测法。方法 PCR扩增U1RNP 70K基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-U1RNP 70K。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western b lot)鉴定。用所表达的蛋白包被硝酸纤维素膜,建立检测U1RNP抗体的斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtrationassay,D IGFA)。结果 PCR产物约为1300 bp,接近于预期的1314 bp,pPIC9k-U1RNP 70K重组阳性克隆测序结果与Gen-Bank中的U1RNP 70K序列完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物U1RNP 70K的相对分子质量约70 000。W estern b lot证实表达产物具有天然U1RNP 70K分子的免疫原性,阴性对照菌无目的条带表达。D IGFA的检测结果与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为94.74%(54/57),阴性符合率为98.00%(49/50),总符合率为96.26%(103/107)。2种方法检测结果无统计学显著差异(P=0.617)。结论在毕赤酵母中成功地高分泌表达了U1RNP 70K蛋白,并建立了简便、快速、准确检测U1RNP抗体的DIGFA方法。

抗SSA和抗RNP在系统性红斑狼疮中的意义

目的:探讨抗SSA和抗RNP在系统性红斑狼疮(SLE)中出现的几率。方法:采用免疫双扩散法(ID)和免疫印迹法(IBT)检测抗SSA、抗RNP。结果:用ID法、IBT法检测系统性红斑狼疮患者抗SSA阳性率高于抗RNP(P<0.05),ID法检测抗SSA,其特异性高于IBT法。结论:联合使用ID法和IBT法检测抗SSA和抗RNP,可以提高系统性红斑狼疮诊断的正确性,减少误诊、漏诊。

系统性红斑狼疮患者抗u1RNP抗体检测的临床意义

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者抗u1RNP抗体阳性的临床意义。方法对2006年6月～2009年6月在我院住院的抗u1RNP抗体阳性的46例SLE患者的临床资料进行分析,并与同期抗u1RNP抗体阴性的SLE患者62例临床资料进行比较。结果抗u1RNP抗体阳性组患者的雷诺现象、关节炎、心肌缺血、肺动脉高压的发生率较高,肾损害程度较轻,抗Sm抗体阳性率较高,两组差异有统计学意义,发热、皮疹、口腔溃疡,血液系统损害,ANA、ENA、ds-DNA阳性率差异无统计学意义。结论抗u1RNP抗体与关节炎、雷诺现象,心肌缺血、肺动脉高压及抗Sm抗体高阳性率密切相关。

RNP进近应用研究

针对传统进近程序存在精度不高、受导航台束缚等问题,本文主要研究PBN运行下的RNP进近方法。本文分析了中国民航主推的RNP进近程序——基于APV Baro-VNAV的进近,预测了RNP进近发展趋势。