刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗对BALB/c小鼠免疫保护性的研究(英文)

目的用刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠观察对机体的影响,为研制安全有效的弓形虫疫苗奠定基础。方法PCR方法从刚地弓形虫基因组中扩增出ROP2和P30片段,将这两个片段分别亚克隆至pET-30a原核表达载体中,表达出ROP2-P30复合重组蛋白。用蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫小鼠后体液中抗体和细胞因子的变化,观察攻击试验小鼠的的死亡率。结果ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠诱导机体产生大量的IgM、IgG抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。攻击试验表明,复合重组蛋白免疫组和对照组相比,小鼠的存活时间明显延长。结论ROP2-P30复合重组蛋白免疫BALB/c小鼠诱导其产生高水平的体液和细胞免疫应答,该复合重组蛋白是抗刚地弓形虫感染的候选疫苗之一。

刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文)

目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。

弓形虫ROP2-P30重组真核表达质粒的构建及其免疫效应的初步分析

目的构建弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)融合的重组真核表达质粒,观察融合抗原ROP2-P30以DNA免疫方式在体内的免疫学效应。方法以重组质粒pET28b/ROP2-P30为模板,利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30,经PCR和酶切鉴定正确后,体外转染COS-7细胞,Westernblot检测ROP2-P30表达。重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30以每鼠100μg混合透明质酸酶10U的剂量肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,以弓形虫虫体裂解抗原作包被抗原,ELISA法测定免疫小鼠血清IgG抗体,免疫结束2周后,以约100个弓形虫速殖子攻击感染小鼠,观察小鼠生存状况。结果PCR和酶切鉴定表明重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建正确;West-ernblot显示该重组质粒在COS-7细胞中瞬时表达的产物可被重组ROP2-P30免疫兔血清识别;ELISA检测重组质粒免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平升高;重组质粒免疫小鼠感染弓形虫后的存活时间较对照组有所延长。结论重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建成功,用该重组质粒DNA直接免疫小鼠,能够诱导产生特异的体液免疫反应,具有一定的免疫保护性;该重组质粒表达的融合抗原分子ROP2-P30具有免疫原性,可作为疫苗候选抗原深入研究。

弓形虫重组耻垢分枝杆菌M.S-P30-ROP2载体活疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定弓形虫P30-ROP2复合基因重组耻垢分枝杆菌M.S载体活疫苗。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒pSTM3,构建重组质粒pSTM3-P30-ROP2,电穿孔法导入耻垢分枝杆菌中,潮霉素筛选、PCR法鉴定阳性转化子,温度诱导表达鉴定。结果获得pSTM3-P30-ROP2重组穿梭表达载体,SDS-PAGE结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kDa。结论成功构建弓形虫复合抗原基因P30-ROP2重组耻垢分枝杆菌疫苗,为弓形虫病的防治提供了一种新方法。

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

目的构建含弓形虫主要表面抗原P30与致密颗粒蛋白ROP2复合基因重组质粒,并在毕赤酵母中表达、纯化与鉴定。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入表达载体,构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-ROP2;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌大量摇瓶表达,纯化产物,免疫活性鉴定。结果获得pGAPZαA-P30-ROP2重组表达载体,SDS-PAGE和Western Blot结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kD,具有一定的免疫活性。结论弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中成功分泌表达,表达产物具有免疫活性,为弓形虫病诊断抗原及疫苗研制奠定基础。

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株 pcDNA3.1 P30 ROP2 真核表达重组质粒,为进一步表达及 DNA疫苗的研制作准备。 方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入 pUC18克隆载体,然后将 pUC18 P30 ROP2中的 P30 ROP2 外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。 结果 从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的 P30、ROP2 片段,克隆成功 pUC18 P30 ROP2 重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3. 1 P30 ROP2重组表达质粒。 结论 成功构建了弓形虫 pUC18 P30 ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功 pcDNA3.1 P30 ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。

弓形虫p30-Rop2复合基因大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒的构建

目的：构建弓形虫p30—Rop2复合基因大肠杆菌／分枝杆菌穿梭表达质粒。方法：利用PCR技术从已构建的pET30-p30-Rop2质粒扩增p30-Rop2复合基因片段，亚克隆于大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒pSTM3，构建重组质粒pSTM3-p30-Rop2，并进行双酶切鉴定和测序分析。结果：成功构建pSTM3-p30-Rop2重组穿梭表达载体，测序结果发现有一个碱基发生突变，但没有改变开放阅读框。结论：pSTM3-p30—Rop2穿梭质粒的成功构建为弓形虫分枝杆菌疫苗的研制提供了前提条件。

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1重组嵌合抗原免疫血清的制备与鉴定

目的制备与鉴定弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)重组嵌合抗原的特异性免疫兔血清。方法将已构建的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,分离上清液和包涵体,包涵体用2mol/L和4mol/L尿素梯度洗涤去杂蛋白,最后用8mol/L尿素溶解洗涤后的包涵体,进行十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),割胶回收目的蛋白,研磨成乳浊状后以背部多点注射免疫大白耳兔,制备免疫兔血清,以免疫扩散试验检测生成的特异性抗体,间接ELISA法测定免疫血清的抗体效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析免疫血清的抗体特异性。结果免疫结束后,通过对流免疫扩散试验检测到了针对rROP2-P30的特异性抗体,间接ELISA法测定到其抗体滴度最高可达1∶12800,Western blotting分析结果表明,此免疫血清与可溶性的重组蛋白、包涵体形式的重组蛋白均能特异性结合。结论得到了针对rROP2-P30重组嵌合抗原的特异性免疫血清。

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1重组复性后体外免疫反应性研究

目的分析基因工程生产的弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)的体外免疫反应性,并对表达产物进行复性处理以获得表达产物的天然构象,为体内免疫学活性的研究作准备。方法重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株,经IPTG诱导的表达产物超声破壁后,SDS-PAGE分析表达产物的表达形式,对产生的重组蛋白ROP2-P30过Sephadex G-25交联葡聚糖柱,经尿素梯度洗脱进行目的蛋白的复性,通过免疫共沉淀反应及免疫印迹实验检测其复性后的重组蛋白的免疫反应性。结果重组质粒pET28b/ROP2-P30在大肠杆菌中以融合形式表达,融合表达的产物主要以包涵体形式存在,该重组蛋白复性后具有明显的免疫反应性。结论利用SephadexG-25交联葡聚糖柱尿素梯度可以复性重组的弓形虫复合蛋白ROP2-P30,该蛋白复性后体外具有免疫反应性,可用于进一步开展弓形虫病复合型疫苗的研制工作。

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1融合基因的克隆与表达

目的进行弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)融合基因的克隆与表达,为弓形虫ROP2-P30基因工程复合抗原的制备做准备。方法半套式PCR扩增编码弓形虫P30的基因片段,克隆至已构建成功的重组质粒pUC119/ROP2中,经PCR和酶切鉴定正确的重组质粒pUC119/ROP2-P30再以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET28b上,鉴定正确的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌表达菌株BL21-Codon Plus(DE3)-RIL,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出700 bp P30基因片段,成功构建重组质粒pET28b/ROP2-P30,该质粒经PCR和酶切鉴定,与预期结果一致,并在大肠埃希菌中高效表达,产生相对分子质量(Mr)约为69 000的重组目的蛋白。结论弓形虫ROP2和P301融合基因克隆成功,并表达出预期的复合重组蛋白ROP2-P30。

pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体并进行293T细胞的转染表达。方法根据pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2重组质粒设计引物,进行PCR扩增,获得HBsAg-p30-ROP2融合基因并进行酶切,酶切片段与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体,酶切和测序鉴定后转染293T细胞,采用荧光、Western blot和ELISA检测其蛋白表达效率;分别用P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗、乙肝患者血清进行ELISA,检测融合蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增HBsAg-p30-ROP2基因片段约2 600bp,与理论值相符。构建的重组质粒pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2经双酶切获到约4 700bp和约2 600bp的两条片段,与预期相符。对重组载体测序,HBsAg基因的252位C→A,345位T→C,ROP2基因的695位A→T,且3个碱基突变均为同义突变。免疫荧光法检测pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2转染成功并正确表达,细胞蛋白浓度2.40mg/ml。提取的融合蛋白能被弓形虫p30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别。结论成功构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体,并在293T细胞中过表达,表达蛋白具有免疫反应性,为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了基础。

pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建与鉴定

目的构建pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因重组表达载体,并对其进行初步鉴定。方法根据重组体pcDNA3-p30-ROP2酶切位点和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因序列等因素设计合成引物,扩增HBsAg目的基因片段,再应用酶切、连接等分子生物学技术将HBsAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表达载体中。应用聚合酶链反应(PCR)初筛,再采用酶切、测序等技术对构建的重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2进行鉴定。结果 PCR扩增出HBsAg基因片段,构建了pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因真核表达载体。PCR与酶切结果显示,该基因片段大小均与理论值相符;测序结果显示该重组表达载体包含了p30-ROP2和HBsAg目的基因的完整序列。结论成功构建了多基因重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2,为进一步研究多基因核酸疫苗奠定了基础。

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达(英文)

目的构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2(ROP2)和主要表面抗原1的重组表达质粒,纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18-T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定,将pMD-ROP2中ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切、连接等反应,亚克隆入pET-30a(+)原核表达载体,构建pET-ROP2载体,然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoⅠ和EcoRⅠ酶切的pET-30a(+)载体连接,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Western blot分析。结果从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。

弓形虫多基因核酸疫苗构建及其免疫保护性研究

目的构建弓形虫多基因核酸疫苗,评价其免疫保护性。方法 PCR扩增热休克蛋白(HSP70)基因片段,克隆到pcDNA3 ROP2 p30重组质粒中,构建pcDNA3 ROP2 p30 HSP70多基因核酸疫苗。采用该疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠脾淋巴细胞及全血CD4+、CD8+,血清、脾淋巴细胞培养液中IgG、IgM、IgA和IFNγ、TNF、IL 2、IL 4、IL 12等,并进行弓形虫攻击感染实验。结果应用PCR扩增出916 bp HSP70基因片段,成功构建pcDNA3 ROP2 p30 HSP70重组体,其中包含HSP70蛋白基因读码框内的完整序列。该弓形虫多基因核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫,实验组小鼠血清抗体滴度高,CD4+和CD8+均增殖明显,组间差异有统计学意义(FCD4+=45.00,FCD8+=15.01,P均<0.01);其血清及脾细胞培养液中IFNγ、IL 2和IL 12含量均明显升高,尤以血清中升高显著。攻击实验结果显示,实验组小鼠存活时间明显延长。结论 pcDNA3 ROP2 p30 HSP70多基因核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生较好的免疫保护作用。