过表达EoRPL11下调HEK293T细胞中蛋白质的翻译活性(英文)

核糖体蛋白L11(RPL11)是真核生物核糖体的重要组成部分.RPL11参与核糖体的生物发生及其它的一些细胞调控过程.本研究在人细胞中研究了游仆虫RPL11(EoRPL11)的亚细胞定位及对蛋白质合成的调控功能.通过激光共聚焦显微镜观察发现,融合绿色荧光蛋白的EoRPL11分布于细胞核中,并集中于核仁上;将EoRPL11和海肾荧光素酶报告基因共转染HEK293T细胞后发现,细胞内海肾荧光素酶的酶活性明显下降,并呈现一种剂量依赖性关系;实时定量PCR分析则表明,海肾荧光素酶的mRNA水平并没有明显改变;同时,细胞的增殖也受到了一定的抑制.以上结果表明,EoRPL11是核蛋白,并且其过表达可能在翻译水平上抑制细胞内总蛋白质的合成.

低温胁迫下鱼类鳃中RPL11/MDM2/P53信号通路相关基因及蛋白表达差异分析

为了研究RPL11/MDM2/P53信号通路在鱼类低温胁迫中所起的作用,分别利用mRNA和蛋白表达水平定量技术,对罗非鱼Oreochromis niloticus和斑马鱼Danio rerio两种抗寒能力不同的鱼类鳃RPL11/MDM2/P53信号通路相关因子在低温胁迫下的表达情况进行分析。结果表明:在相同低温胁迫下,罗非鱼鳃中RPL11和P53蛋白表现出随着低温胁迫时间延长而增加的趋势,但斑马鱼鳃中P53蛋白开始增加的时间点晚于罗非鱼;罗非鱼鳃中mdm2转录表达量在8℃、6 h后显著升高(P<0.05),表明mdm2表达量升高可能活化P53;8℃、6 h后P53下游靶基因bad和p21在罗非鱼鳃中出现表达量升高的情况,这与罗非鱼中6 h时P53蛋白表达量升高是一致的,但在斑马鱼中p21基因表达量变化不大。研究表明,低温能诱导罗非鱼中与凋亡相关的RPL11/MDM2/P53通路中相关蛋白的变化,并且这种表达变化模式与耐低温能力较强的斑马鱼不同,这种物种差异性的基因表达模式可能是不同鱼类低温耐受能力差异的原因之一。

新城疫病毒对宿主核糖体蛋白RPL11降解机制的初步研究

本研究使用蛋白标记药物Puromycin标记NDV感染后DF-1细胞新合成的蛋白,发现NDV感染后新蛋白合成量显著下调,而病毒NP蛋白的含量却随感染时间的延长呈增加趋势。为探究NDV的感染对DF-1细胞核糖体大亚基L11蛋白(RPL 11)表达水平的影响,分别收获NDV(MOI 1)感染后不同时间(8 h、16 h、24 h和32 h)和不同剂量NDV(MOI 1、0.1)感染后相同时间的细胞样品,采用western blot、激光共聚焦、荧光定量PCR分别检测内源性RPL 11的蛋白表达和mRNA转录水平。Western blot结果显示NDV感染后核糖体蛋白RPL 11的表达量显著降低,并且与病毒感染时间和感染剂量呈正相关。激光共聚焦结果显示,NDV感染后细胞核与细胞质中的RPL 11荧光信号均明显减弱。但荧光定量PCR结果显示,该基因的转录水平却无明显变化,表明其蛋白表达量的减少发生在翻译后修饰环节。构建重组质粒pFlag-RPL 11转染DF-1细胞24 h后再感染不同剂量NDV(MOI 1、0.1),通过western blot检测外源性RPL 11的表达水平。结果显示外源性RPL 11蛋白的表达量在病毒感染后也呈明显下降趋势,并也与病毒感染剂量呈正相关。在NDV感染(MOI 1)的DF-1细胞培养基中添加泛素蛋白酶体抑制剂MG132,病毒滴度测定结果表明该药物对病毒增殖无明显影响,却能够显著抑制NDV感染后RPL 11蛋白的降解,表明RPL 11的降解依赖泛素蛋白酶体途径。上述结果证实NDV感染细胞后能够引起RPL 11蛋白的泛素化降解,且该降解过程能够被MG132所抑制。本研究为解析NDV感染后宿主细胞内蛋白翻译的变化提供了新的着眼点。

纯红细胞再生障碍性贫血临床特点与RPS19、RPL5、RPL11基因突变之多中心研究

目的通过对纯红细胞再生障碍性贫血的临床回顾与RPS19、RPL5、RPL11基因突变的检测,分析比较先天性纯红细胞再生障碍性贫血与获得性纯红细胞再生障碍性贫血的临床异同和RPS19、RPL5和RPL11基因突变情况。方法 20例来自多中心的儿童纯红细胞再生障碍性贫血,先天性14例,获得性6例,分析临床资料并比较两组发病年龄、外周血细胞计数和对治疗的反应。Sanger双脱氧链终止法对患儿RPS19、RPL5和RPL11基因测序。结果先天性纯红细胞再生障碍性贫血42.8%伴有先天畸形,与获得性纯红细胞再生障碍性贫血比较,网织红细胞较低(P<0.05),外周血WBC、HGB和PLT无差异。激素治疗有效率分别是:先天性78.6%、获得性100%(P<0.05)。先天性纯红再障7.1%检出RPS19点突变,获得性纯红再障未发现RPS19突变。先天性纯红再障和获得性纯红再障RPL5和RPL11基因均未发现突变。结论先天性纯红再障42.8%合并畸形,网织红细胞均低于获得性纯红再障,RPS19突变率低于国外文献报道。RPS19突变可能与先天性纯红再障有关。获得性纯红再障发病与RPS19、RPL5和RPL11基因异常可能无关。

Cloning RPL11 cDNA 3' End by SMART RACE Technique

RT-PCR and RACE techniques were used to clone 3＇ end real sequence of RPL11 gene from a goat. The sequences included some non-structural protein （3D） genes, and 3D gene immediately downstream 3＇ non-coding region （UTR） and poly （A） tail. The results showed that the length of specific amplified fragment was 566 bp （not including polyA tail）. RPL11 gene encoded 188 amino acids, amino acid sequence was conducted for homology analysis by NCBI BLAST tool. The highest homology was Mus （RPL11, mRNA homology 99%）, followed by Bos （RPL11, mRNA homology 96%）, and the next was Hs （RPL11, mRNA homology of 93%）.

猪脑心肌炎病毒3AB蛋白与宿主蛋白RPL11相互作用的鉴定

为了研究与猪脑心肌炎病毒(EMCV)3AB相互作用的宿主蛋白,本实验采用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞cDNA酵母表达文库,获得6个与EMCV 3AB相互作用的宿主蛋白(RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20和LGALS1),经分析显示这些蛋白分别参与DNA复制、有丝分裂和细胞凋亡等过程;酵母共转化试验与免疫共沉淀试验证实EMCV 3AB和RPL11两者之间存在特异性结合;激光共聚焦试验显示EMCV 3AB与RPL11共同过度表达时,二者共定位在细胞核中,而在EMCV感染状态下,3AB与RPL11主要共定位在细胞质中。另外,EMCV感染HeLa细胞能降低细胞中p53的蛋白水平,但3AB并不直接促进p53蛋白降解,表明EMCV 3AB对RPL11-MDM2-p53通路无影响。本研究发现并证实了RPL11与EMCV 3AB之间的相互作用,为进一步研究RPL11蛋白在EMCV复制中的作用奠定了基础。

RPL11基因稳定敲低细胞系的构建及验证

针对RPL11基因设计三条不同的shRNA,并分别克隆至带绿色荧光标签的pRNAT-U6.1载体,以用于构建RPL11稳定敲减的细胞系。将重组质粒转染至HeLa细胞中并加入G418进行筛选,随后通过有限稀释法将阳性细胞亚克隆纯化。将扩大培养的亚克隆细胞进行Western blot和qPCR实验验证获得RPL11基因稳定敲低的细胞株。利用CCK-8细胞活力检测试剂盒和Puromycin标记法测定RPL11基因稳定敲低细胞系的生长活力和新生蛋白合成能力,结果表明,RPL11基因稳定敲低后并不影响细胞的活力和新生蛋白合成能力,该细胞系为后续研究RPL11的非核糖体功能奠定了基础。