青藏高原牦牛多杀性巴氏杆菌荧光定量RQ-PCR检测方法的建立

参照GenBank中已发表的多杀性巴氏杆菌种特异性基因KMT-1的保守序列设计1对引物,建立了牦牛多杀性巴氏杆菌实时荧光定量RQ-PCR检测方法。获得的标准曲线相关系数R值为0.9998,标准曲线的线性范围达到1.0×100～1×1010拷贝。对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌和伤寒沙门菌等非巴氏杆菌进行检测,结果均为阴性。结果表明,本研究建立的荧光定量RQ-PCR方法敏感性高,特异性强,为青藏高原牦牛多杀性巴氏杆菌病的早期诊断及分子流行病学调查提供了一种新的快速检测方法。

FISH与RQ-PCR监测慢性髓系白血病患者造血干细胞移植后微小残留病

背景与目的:监测慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)的微小残留病(minimal residual disease,MRD)的常用方法有间期荧光原位杂交(interphase fluorescence in situ hybridization,FISH)和实时定量逆转录-聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription PCR,RQ-PCR)。本研究分析用FISH和RQ-PCR两种方法在CML造血干细胞移植后不同时间点监测MRD的意义。方法:采用间期FISH和RQ-PCR技术,对31例异基因造血干细胞移植前后的CML患者骨髓细胞进行BCR-ABL融合基因定期监测,随访时间3～48个月。结果:31例患者移植后,前30个月各时间点FISH检测的阳性细胞数及RQ-PCR检测的BCR-ABL/ABL比值均较移植前明显下降,下降>2个对数值(P<0.05);移植30个月后FISH检测结果为0时,RQ-PCR仍然能检测出BCR-ABL/ABL的表达水平,与移植前相比,30个月后各时间点BCR-ABL/ABL比值下降>3个对数值(P<0.05)。结论:FISH和RQ-PCR方法检测BCR-ABL融合基因有较好的一致性。RQ-PCR连续监测MRD的敏感性更高,MDR的定量分析有利于评估疗效和指导个体化治疗。

成人急性白血病GST-π与LRP基因的RQ-PCR检测及其临床意义

本研究通过对急性白血病(AL)患者外周血谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)和肺耐药相关蛋白(lungresistance-related protein,LRP)基因的检测,探讨两种基因与患者多药耐药性的关系。采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RQ-PCR)检测44例AL患者及27例正常人外周血单个核细胞GST-π与LRP基因的表达。结果表明,GST-π基因水平在初治组和难治组与完全缓解组之间均有极显著性差异(P<0.01)。LPR基因水平在初治组与难治组,完全缓解组与难治组均有极显著性差异(P≤0.01)。GST-π与LRP基因之间无相关性。GST-π及LRP基因表达在不同外周血白细胞计数组、不同临床分型组(ALL、ANLL)之间的差异均不显著。结论:GST-π和LRP基因通过不同机制引起多药耐药,二者联合检测较单独测定某一基因对白血病评定预后更具临床意义。外周血白细胞计数、白血病分型可能与GST-π和LRP基因的表达无关。

RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排监测急性淋巴细胞白血病患儿治疗过程微小残留白血病

目的研究RQ-PCR检测急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿Ig/TCR基因重排在微小残留白血病(MRD)监测中的作用。方法以2009年3月至2011年3月在广州市妇女儿童医疗中心血液肿瘤科确诊和治疗的ALL患儿为研究对象,PCR检测初诊ALL患儿的Ig/TCR基因重排;基因扫描分析初诊患儿Ig/TCR基因重排的克隆特性;对ALL患儿的单克隆性Ig/TCR基因重排进行测序,RQ-PCR检测不同治疗阶段Ig/TCR基因重排的表达量。结果 86例ALL患儿进入分析,男52例,女34例;年龄1～13(4.3±3.0)岁,随访时间1～26(14.3±7.0)个月。①83例(96.5%)检出1种或以上Ig/TCR基因重排,共检出209个Ig/TCR基因重排;②91.8%(56/61例)检出1种或以上单克隆性Ig/TCR基因重排;61例172个Ig/TCR基因重排中,单克隆性、寡克隆性和多克隆性Ig/TCR基因重排的检出率分别为58.1%(100个)、30.8%(52个)和11.0%(19个),差异有统计学意义(P=0.000);③26例完成连续3次随访,其中22例持续完全缓解患儿的Ig/TCR基因重排平均相对表达量持续下降,在维持治疗前均为MRD阴性(≤1.0×10-4);4例复发患儿在诱导缓解治疗后至复发前各检测时点Ig/TCR基因重排表达量均>1.0×10-4,并在复发前已有回升,从开始回升至临床复发的平均时间为3.75(2～8)个月。结论 Ig/TCR基因重排相对表达量可反映MRD水平,可作为判断预后、监测复发和指导治疗的有效手段。

应用实时荧光定量RT-PCR检测急性髓系白血病患者aml1／eto融合基因的临床意义分析

本研究目的旨在构建实时荧光定量RT-PCR(RQ-RT-PCR)方法检测用的am l1/eto融合基因的RNA标准品,并以此作为工具监测急性髓系白血病M2患者微小残留病(MRD)的状态。应用定性的RT-PCR筛选患者标本中的am l1/eto融合基因,经体外扩增转录,得到1010拷贝数RNA标准品,并对37例患者骨髓/外周血标本进行了检测。结果表明:构建的RNA标准品具有线形良好的标准曲线,扩增效率较高,特异性较好;患者初诊组和复发组的目的基因am l1/eto的相对值的平均值高于完全缓解组(CR)(p<0.05);随访的患者中初诊时目的基因am l1/eto的相对值很高,完全缓解时降低,复发时明显升高。初诊和CR两个时间点目的基因am l1/eto的相对值相差2个数量级以上时,病人的复发危险性相对较小,如果am l1/eto基因的相对值持续升高,则提示患者的预后较差。结论:RQ-RT-PCR方法检测am l1/eto融合基因的敏感性和特异性比较高,可信度和稳定性较好;对am l1/eto融合基因阳性患者MRD定量动态监测有助于初步评价治疗效果,估计患者的复发危险度,因此有望成为确定强化治疗的时机、延长病人完全缓解期的重要手段。

实时荧光定量RT-PCR检测SALL4基因的临床应用研究

本研究旨在建立实时荧光定量RT-PCR(FQ RT-PCR)检测婆罗双树样基因4(sal-like4,SALL4)mRNA的方法并研究该基因在各类型白血病中表达情况。应用实时荧光定量RT-PCR技术定量检测60例急、慢性白血病患者和10例志愿者的标本SALL4基因。结果表明,SALL4基因在完全缓解(CR)组各类型白血病中不表达或低表达,与对照组相比无显著差异(P>0.05),而在初诊和复发组中高表达,表达量显著高于CR组(P<0.05),但在初诊和复发两组间表达量无显著差异(P>0.05),其中SALL4基因在CLL、T-ALL、M3中不表达或低表达;相关BMI-1基因与其表达规律一致,两者显著相关(r=0.825,P<0.01)。结论:实时荧光定量RT-PCR技术检测SALL4基因具有高敏感性和高特异性等优点,可作为进一步研究SALL4基因的方法;SALL4基因有可能成为部分白血病治疗转归及白血病微小残留病(MRD)监测指标之一。

实时定量PCR在乙型肝炎(HBV)诊断中的应用

随着对乙型肝炎治疗的深入研究 ,对乙型肝炎病毒 (HBV DNA)数量的确诊显得尤其重要。本文采用RealTimeQuantitativePCR(简称RQ PCR)方法 ,对 2 84例经ELISA检定的乙型肝炎患者血清标本进行HBV DNA定量检测。结果有 96例HBsAg(+ ) HBeAg(+ ) HBcAb(+ )的血清标本RQ PCR阳性率为 10 0 % ,病毒平均量 5 0 2× 10 5拷贝 μl;87例HBsAg(+ ) HBeAb(+ ) HBcAb(+ )的血清标本RQ PCR阳性率为 4 4% (38例 ) ,病毒平均量 1 0 2× 10 3 拷贝 μl,5 3例HBsAg(+ ) HBcAb(+ )的血清标本RQ PCR阳性率为 5 8% (31例 ) ,病毒平均量 6 6 9× 10 4拷贝 μl;而 4 6例正常对照组经检测全为阴性。可见RQ PCR的检测结果反映了不同患者的病情 ,对乙型肝炎的诊断、治疗具有临床指导价值。

NF-κB mRNA在急性髓系白血病中的表达

本研究目的旨在应用实时定量PCR技术(qPCR)检测急性髓系白血病(AML)患者NF-κB mRNA的表达,以揭示NF-κB在AML发病中的作用。收集60例初诊AML患者的新鲜骨髓,用TRIzoL一步法提取总RNA,合成cDNA,以GAPDH为内参照进行荧光定量检测NF-κB mRNA的表达;在实验中选择12例正常人作为对照。结果表明,NF-κB mRNA在AML患者中的表达高于正常人,差异显著(p<0.05)。M4,M5亚型的NF-κB mRNA表达高于M1,M2,M3亚型组。结论:NF-κB在AML中表达升高,其表达上调在AML的发病中可能起了重要作用。

肺鳞癌组织中Annexin-1的表达及意义

目的检测肺鳞癌组织中膜联蛋白Ⅰ(Annexin-1,Anx-A1)的表达水平,探讨其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)和Western blot方法检测22例肺鳞癌组织及其相应癌旁正常组织中Anx-A1 mRNA及蛋白的表达水平,并分析其与临床病理指标的关系。结果肺鳞癌组织中Anx-A1 mRNA和蛋白的表达水平均高于癌旁正常组织,在低分化肺鳞癌组织中的表达水平高于高、中分化肺鳞癌组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。Anx-A1在早期(Ⅰ期+Ⅱ期)肺鳞癌组织和非早期(Ⅲ期)癌组织中表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Anx-A1在肺鳞癌中表达上调,可能与肺癌的发生、发展相关。

荧光定量PCR对伊马替尼治疗后慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因变化的检测效果研究

目的应用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术检测慢性粒细胞白血病(CML)患者应用伊马替尼治疗后bcr/abl融合基因的水平,并比较RQ-PCR与荧光原位杂交(FISH)在检测CML微小残留病方面的敏感度。方法采用RQ-PCR技术检测初诊CML患者30例,以及应用伊马替尼治疗1年、2年的CML患者各8例,观察骨髓细胞中bcr/abl融合基因转录本的表达情况,并与荧光原位杂交(FISH)结果进行比较。结果RQ-PCR检测bcr/abl融合基因的敏感性可达到10个拷贝。初诊CML患者bcr/abl融合基因水平为68.18%±26.67%,而经伊马替尼治疗1年、2年后的水平分别为0.16%±0.15%、0.04%±0.02%,与治疗前相比,分别下降了2.82和3.36个对数级。当FISH结果为阴性时,RQ-PCR的检测结果仍为阳性。结论RQ-PCR检测bcr/abl融合基因的敏感性比FISH更高,对于监测伊马替尼治疗过程中分子水平的变化、提示病情发展具有重要的应用价值。

运动疲劳对小鼠海马GDNF及其受体GFRα-1 mRNA表达的影响

目的:观察运动疲劳对小鼠海马胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)及其受体GFRα-1 mRNA表达的影响,探讨运动疲劳的神经生物学机制。方法:20只昆明种小鼠随机分为对照组和实验组,实验组进行连续4周的无负重递增强度游泳,每周游泳时间依次为30、60、90和120分钟,每天训练1次,每周6天,休息1天。对照组动物于相同条件下常规饲养,不参加游泳训练。最后一次运动后即刻取材。观察两组小鼠体重,血清肌酸激酶、尿素氮、睾酮指标,并采用实时荧光定量PCR法分析两组小鼠海马GDNF、GFRα-1 mRNA表达水平。结果:实验组体重、血清睾酮水平较对照组明显降低,血清肌酸激酶、尿素氮值较对照组显著升高,海马GDNF、GFRα-1 mRNA表达水平较对照组显著升高(P<0.05)。结论:运动疲劳引起小鼠海马GDNF和GFRα-1 mRNA表达水平上调,提示GDNF和GFRα-1参与了运动疲劳产生的神经生物学调控过程。

旋毛虫43ku ES抗原基因表达水平的实时荧光定量PCR检测

根据GenBank中旋毛虫43 ku ES抗原基因(Ts43)序列设计引物和探针。以管家基因18 SrRNA为内参基因,对旋毛虫总RNA进行归一化处理,根据循环阈值(Ct值)的变化计算Ts43基因的表达量,建立检测旋毛虫Ts43表达量的实时荧光定量PCR方法,并用该方法测定旋毛虫不同寄生时期Ts43基因的表达水平。结果显示,旋毛虫Ts43基因在各寄生时期均有表达,成虫和新生幼虫Ts43基因的表达水平相对于其他寄生时期的虫体低,该基因表达量在感染后第18 d开始逐渐上升,于感染后第30 d达到高峰,而后开始逐渐下降,但感染后第58 d的虫体Ts43基因表达水平仍高于成虫和新生幼虫。结果表明,Ts43基因的表达与保姆细胞的形成有较大关系。

实时荧光定量PCR检测RSV胁迫下抗病、感病水稻中与脱落酸相关基因的差异表达

采用实时荧光定量PCR方法测定了水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)胁迫下抗性不同品种水稻中与脱落酸相关基因的mRNA转录水平变化。结果表明:感病品种武育粳3号中WGP1、OsGASA2、Polcalcin、Os-CBL4、Myb和OsCIPK15基因表达水平均上调,上调比率分别为4.96、5.17、2.01、5.17、12.04和7.84。而抗病品系KT95-418中,OsGASA2和OsCIPK15基因表达水平下调,下调比率分别为1/5.40和1/2.08;Polcalcin和Myb基因表达水平上调,上调比率分别为4.20和3.86;WGP1和OsCBL4表达量变化不明显。这些结果表明,RSV胁迫能诱导脱落酸相关基因表达量的变化,并且在抗病、感病水稻品种中的表达特征不同,从而提示植物激素脱落酸可能调控了RSV胁迫条件下相关基因的表达。

实时荧光定量PCR技术在植物中的应用

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累来实现实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术实现了PCR从定性到定量的转变。介绍了实时荧光定量PCR技术的原理、分类及优缺点,综述了近年来实时荧光定量PCR技术在植物中的应用概况及其研究进展,旨在为该技术的进一步开发应用提供理论参考。

实时定量PCR监测B细胞恶性肿瘤患者造血干细胞移植后的IgH水平及意义

本研究评价实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测IgH水平对B细胞恶性肿瘤患者造血干细胞移植(HSCT)后残留肿瘤细胞监测的意义。采用家族一致性TaqMan探针联合等位基因特异性寡核苷酸(ASO)上游引物技术检测22例B细胞恶性肿瘤患者HSCT前后骨髓单个核细胞的IgH水平动态变化。IgH水平以内参基因GAPDH进行归一化。结果表明,RQ-PCR实验可重复灵敏度为1个拷贝。9例IgH单克隆重排患者,在HSCT后1个月骨髓中IgH的拷贝数较初治时明显降低(6.67×103/106GAPDHvs29/106GAPDH,p<0.01)。3例移植后15个月IgH的拷贝数持续小于102/106GAPDH,18个月后IgH水平为0的患者获得了完全的临床和分子遗传学缓解(CCyR);5例移植后3个月以内IgH拷贝数持续小于102/106GAPDH,随后IgH拷贝数持续小于103/106GAPDH的患者临床获得完全缓解(CR)。1例患者移植后近3个月时IgH拷贝数为4.5×103/106GAPDH,4个月时临床复发。RQ-PCR检测8例干细胞采集物的肿瘤污染水平为3.68×102(0-1720)/106GAPDH,外周血采集物中的肿瘤污染小于骨髓[75(0-890)/106GAPDHvs1.1×103(527-1720)/106GAPDH,p<0.05]。采集物可用于RQ-PCR检测的8例患者无论肿瘤污染程度如何,临床均无复发。采集物中肿瘤污染的水平与初治及移植后1个月的IgH水平呈正相关(r值分别为0.810、0.708,p<0.05)。结论:RQPCR能够有效监测B细胞恶性肿瘤患者移植后IgH水平动态变化。移植后3个月内IgH拷贝数大于103/106GAPDH可能是预测患者复发的标志。

多重实时定量PCR检测BCR—ABL mRNA方法的建立

目的建立一种快速、可靠的实时定量PCR（RQ-PCR）检测BCR-ABL mRNA的方法。方法应用LightCycler技术，设计在同一PCR反应管内可扩增b3a2、b2a2、ela2几种常见的BCR-ABL转录本和b3a3、b2a3等少见转录本，并对RQ-PCR主要要素进行优化，评价优化后RQ-PCR的敏感性、特异性和可靠性。结果建立的RQ-PCR方法可检出10^3健康人单个核细胞中的1个K562细胞，最低可检出100个拷贝BCR—ABL分子。BCR—ABL和ABL的循环域值（C1）值（拷贝数）批内变异系数分别为0．68％（12．93％）和0．59％（8．60％），批间变异系数分别为1．14％（18．89％）和1．01％（12．72％）。结论RQ-PCR可作为评价慢性粒细胞白血病（CML）疾病进展、预后判断和骨髓移植后微量残留白血病监测的灵敏、可靠的方法。

辛伐他汀对体外培养鼠骨形成蛋白BMP-2基因的调控

目的研究辛伐他汀对鼠骨形成蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)及其m RNA表达的影响,验证辛伐他汀是否能够促进鼠成骨细胞的骨形成.方法将兔子分为假手术组,模型组和辛伐他汀组3个小组,每组6只.在辛伐他汀组用药1月、2月和4月时,收集各组兔子的耳中央动脉血清,将上述血清加入鼠MC3T3-E1细胞培养4d后提取总RNA,逆转录出骨形成蛋白BMP-2的cDNA后进行实时荧光定量PCR,对产物进行检测.结果用药1个月,辛伐他汀组BMP-2表达量较假手术组高2.79倍(P=0.0004),较模型组高2.66(P=0.001);用药2个月,辛伐他汀组BMP-2表达量较假手术组高1.88倍,较模型组高1.75倍(P=0.001);用药4个月,辛伐他汀组BMP-2表达量较假手术组高0.86倍(P=1.000),较模型组高1.04倍.结论辛伐他汀对骨形成有正效应.

联合检测WT1基因和COX-2基因表达在急性白血病的临床价值

目的 通过观察急性白血病（AL）患者WT1基因（WT1 mRNA）和COX-2基因（COX 2 mRNA）的表达情况,探讨其相关关系及临床检测价值.方法 125例初诊AL患者为研究对象,采用实时荧光定量PCR（RQ PCR）动态检测WT1mRNA和COX-2 mRNA的表达水平,并分析其与临床参数的相关性.结果 初诊AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA表达水平（中位数157.7和163.2）均显著高于正常对照组（中位数1.65和0.87） （P＜0.01）,且WT1 mRNA与COX-2mRNA表达水平呈相关性（r=0.509,P＜0.05）.初诊AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA的表达水平显著高于缓解组（中位数3.65和4.37）（P＜0.05）;缓解组AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA的表达水平与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）;复发组AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA的表达水平（中位数167.9和178.5）与初诊组的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）.WT1 mRNA表达水平在AL各亚型之间差异有统计学意义（X2=423.567,P＜0.01）,M5WT1 mRNA表达水平最低,M3表达最高.结论 AL患者WT1基因与COX-2基因表达水平存在相关性,联合检测WT1 mRNA和COX-2 mRNA,可作为AL患者疗效评价、监测微小残留病和预后判断的指标,为临床化疗方案个体化提供更可靠的依据.

外周血Bcl-2/IgH融合基因检测的可行性探讨

目的探讨外周血作为Bcl-2/IgH融合基因检测的标本来源的可行性。方法以SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法检测20例患者外周血和5例骨髓Bcl-2/IgH融合基因的阳性率及表达水平。结果骨髓和外周血Bcl-2/IgH融合基因的阳性检出率分别是80%与65%,两者阳性率经统计学分析差异无显著性(P=0.64);外周血和骨髓融合基因相对拷贝数x軃±sd分别为2.73±2.54和4.23±4.06,经统计学分析差异无显著性(P=0.107)。结论以外周血作为Bcl-2/IgH融合基因观测的标本来源有一定的可行性,值得进一步研究。

38例不同病期慢性粒细胞白血病患者bcr-abl基因的表达

目的 探讨慢性粒细胞白血病(CML)不同病期bcr-abl基因的表达。方法 应用RQ-PCR方法检测38例共45份不同临床分期CML病人外周血中bcr-abI的表达水平。结果 CML病人的bcr-abl基因和bcr-abl/abl比率在慢性期分别为(11542±5106)拷贝/μg总RNA和(10.58±5.12)％;加速期分别为(83350±7844)拷贝/μg总RNA和(84.20±3.78)％;急变期分别为(79112±7956)拷贝/μg总RNA和(80.15±4.16)％。bcr-abl基因表达水平与CML不同临床病期密切相关。结论 RQ-PCR检测bcr-abl基因表达可作为CML疾病进展、预后判断和骨髓移植后微小残留疾病监测的良好指标。