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Cloning of Na^+/H^+ antiport gene from Dunaliella salina
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作者 KONG Fanjing CHEN Susu 《Acta Geologica Sinica(English Edition)》 SCIE CAS CSCD 2014年第S1期78-79,共2页
1 Introduction Dunaliella Salina,which taxi Dunaliella,Volvocales,Chlorophyceae Chlorophyta,is unicell algae with double flagllum at top,and cup shaped chloroplast without cell wall.Dunaliella Salina is the most salt ... 1 Introduction Dunaliella Salina,which taxi Dunaliella,Volvocales,Chlorophyceae Chlorophyta,is unicell algae with double flagllum at top,and cup shaped chloroplast without cell wall.Dunaliella Salina is the most salt tolerance eucaryotes.It can grow at the range of salt concentration 展开更多
关键词 Dunaliella.Salina Na+/H+ antiport gene gene cloning degenerate primers rt-PCR.
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猪传染性胃肠炎病毒RT-CPA检测方法构建及初步应用
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作者 赵子惠 陈伯祥 +3 位作者 王佳 成伟伟 杨明 李元新 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期65-71,共7页
为开发一种猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)RT-CPA快速且准确的检测方法。本试验根据TGEV S基因的D序列,设计了3对引物,使用构建的重组质粒作为标准阳性对照,通过优化筛选条件并应用可视化核酸试纸条,成... 为开发一种猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)RT-CPA快速且准确的检测方法。本试验根据TGEV S基因的D序列,设计了3对引物,使用构建的重组质粒作为标准阳性对照,通过优化筛选条件并应用可视化核酸试纸条,成功建立了一种一步法TGEV RT-CPA检测方法。本实验筛选最优条件为:Mg^(2+)浓度1.0 mmol/L,dNTP浓度0.8 mmol/L,Betaine浓度1.0 mol/L,BstDNA聚合酶浓度8.0 U,反应温度63℃,反应时间60 min,AMV逆转录酶5 U。本研究的扩增产物通过凝胶电泳显示出梯形条带,证明了其对TGEV的特异性检测和重复性良好,灵敏度高达10拷贝/μL。初步应用显示,该方法与TGEV抗原快速检测试剂盒的符合率超过90%,显示了高灵敏度。TGEV RT-CPA方法免去了RNA提取和cDNA合成的步骤,能够完成一步检测,且该方法不需要特殊仪器,适用于现场快速检测TGEV,为快速诊断和防控猪传染性胃肠炎提供了新的技术选择。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 rt-CPA S基因 检测方法
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基于ORF7基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA检测方法的建立
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作者 于娜 马佳镁 +6 位作者 张紫薇 黄春媛 范悦轩 郑佳馨 张艳 刘光亮 曹宗喜 《动物医学进展》 北大核心 2024年第8期117-119,共3页
根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)... 根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)copies/μL;与PRVBartha-K61、PCV、CSFV、PRRSVGD、PRRSVXH-GD、PRRSVGM2、PRRSVCH-1a病毒均无交叉反应。分别对157份样品进行荧光RT-RAA法与PCR方法的检测进行比对,结果显示,荧光RT-RAA法敏感性为94.0%,特异性为100%。建立的PRRSV荧光RT-RAA法操作简便,特异性强,灵敏度高。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因 反转录-重组酶介导等温扩增 特异性 灵敏度
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RT-fqPCR检测腐乳耐药基因方法的建立及应用
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作者 张娜娜 刘洋 +2 位作者 赵磊 赵燕 俞漪 《中国酿造》 CAS 北大核心 2024年第5期237-241,共5页
该研究根据腐乳中微生物全基因组测序结果中耐药基因的丰度筛选出3种耐药基因(Baca、Emra、Imrp)设计引物,建立一种非培养方式—实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)方法检测不同腐乳样品中微生物可能存在的耐药基因,并对该方法的灵... 该研究根据腐乳中微生物全基因组测序结果中耐药基因的丰度筛选出3种耐药基因(Baca、Emra、Imrp)设计引物,建立一种非培养方式—实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-fqPCR)方法检测不同腐乳样品中微生物可能存在的耐药基因,并对该方法的灵敏度、抗干扰能力及重复性进行检测,最后应用于市售腐乳样品中耐药基因的检测。结果表明,建立的RT-fqPCR方法对3种耐药基因检测的灵敏度较高,均达到5.4 pg;添加黄豆基因对检测结果影响不显著,抗干扰能力较好;重复性试验结果的相对标准偏差(RSD)均<1.8%,重复性较好。采用该方法对市售的47批次腐乳样品进行检测发现,3种耐药基因Baca、Emra、Imrp在腐乳中的检出率较高,分别为96.5%、92.2%和97.2%;青方腐乳、白方腐乳、红方腐乳3类腐乳含有的耐药基因分别为84.4%、83.3%和89.6%。综上,建立的RT-fqPCR方法可快速检测不同腐乳中的3种耐药基因。 展开更多
关键词 腐乳 微生物 实时荧光定量聚合酶链式反应 耐药基因 检测
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基于CP基因的云南烟草花叶病毒RT-LAMP快速检测体系的构建 被引量:1
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作者 赵正婷 盖晓彤 +3 位作者 张俊蕾 卢灿华 姜宁 刘雅婷 《山东农业科学》 北大核心 2024年第5期154-162,共9页
为快速检测云南烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),本研究根据来自云南烟草TMV分离物的外壳蛋白(CP)基因保守核苷酸序列,设计了5组引物进行筛选,并采用单一变量法对反应的温度、时间、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度及内、外引... 为快速检测云南烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),本研究根据来自云南烟草TMV分离物的外壳蛋白(CP)基因保守核苷酸序列,设计了5组引物进行筛选,并采用单一变量法对反应的温度、时间、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度及内、外引物浓度比等进行逐一优化,建立了云南烟草TMV逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系。结果表明,最佳引物组为第4组,最适反应温度为60℃,甜菜碱、dNTPs、Mg^(2+)的最佳反应浓度分别为0.6、0.4、2.0 mmol/L,最佳内、外引物浓度比为4∶1,最佳反应时间40 min。优化后的RT-LAMP经SYBR Green I染色可肉眼判断结果,特异性高,灵敏度是常规RT-PCR的10倍。RT-LAMP检测体系的建立为云南烟草TMV的检测提供了一种便捷、高效、可靠的方法。 展开更多
关键词 烟草花叶病毒 CP基因 rt-LAMP 特异性 灵敏度
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马病毒性动脉炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 梁歆歆 王科珂 +6 位作者 蒋刚强 徐军 陈凯云 王艳 肖媛媛 白梅花 刘东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期159-163,共5页
为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的... 为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×10^(7)拷贝/μL~1.6×10^(2)拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R^(2)=0.9927,初步建立了EAV荧光定量RT-PCR方法。采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×10^(2)拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好。采用本实验建立的荧光定量RT-PCR方法和文献发表的EAV荧光定量RT-PCR方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%。本研究建立的荧光定量RT-PCR检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路。 展开更多
关键词 马病毒性动脉炎 ORF7基因 荧光定量rt-PCR
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鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 张靖鹏 陈翠腾 +5 位作者 林琳 付环茹 李兆龙 江斌 黄瑜 万春和 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期860-866,共7页
旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进... 旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。 展开更多
关键词 信鸽 鸽微RNA病毒 3 C基因 序列分析 实时荧光定量rt-PCR方法
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猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-RAA检测方法的建立及应用
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作者 王恋春 郑辉 +7 位作者 张慧 沙洲 房琳琳 尼博 董雅琴 魏荣 崔进 郑泽中 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第20期63-68,74,共7页
为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-tran... 为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)检测方法,对该方法进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验,并分别采用该方法和实时荧光定量RT-PCR检测方法对72份猪淋巴结、肝脏等组织临床样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的实时荧光RT-RAA方法在41℃条件下反应20 min即可完成检测,对PEDV的最低检测限为1×10~1拷贝/μL;且仅能检测出PEDV,与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRoV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV-4)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)均无交叉反应;相同拷贝浓度的质粒标准品3次重复的扩增曲线几乎重合,起峰时间与荧光值没有明显差异。对72份临床样品进行检测,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。说明建立的实时荧光RT-RAA方法敏感性高,特异性和重复性良好,同时耗时短、操作简单,可用于PEDV的临床检测。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 N基因 猪流行性腹泻 实时荧光rt-RAA 检测方法
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O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 张展 陈信全 +2 位作者 冯国金 黄慧贤 利光辉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期601-607,共7页
为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定... 为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测临床常见猪病毒,结果显示可同时检测出FMDV-O和SVV核酸,且与猪水泡性口炎病毒(VSV)、猪水疱病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)、A-1型口蹄疫病毒(FMDVA-1)核酸均无交叉反应,并可检测到FMDV-O PanAsia株、cathay株、Ind-2001株和Mya-98株等主要流行株,特异性强;该方法对含FMDV-O和SVV拼接质粒标准品的最低检测限为7.17×10^(2)拷贝/μL,敏感性高;利用该方法检测了同一时间和不同时间提取的3种不同浓度的质粒标准品,结果显示批内和批间重复性试验Ct值的变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验所建立的方法对30份临床样品进行检测,结果与各病毒单一荧光定量RT-PCR检测结果一致。本研究建立的FMDV-O和SVV双重荧光定量RT-PCR方法能够快速准确的鉴别检测FMDV-O和SVV,为口岸检疫的快速通关提供了技术手段。 展开更多
关键词 O型口蹄疫病毒 塞内卡病毒 双重rt-qPCR方法 P3基因 VP2基因
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猪δ冠状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 孙彦婷 康宇 +5 位作者 路亚男 井汇源 董望 李向辉 王金合 唐光武 《现代牧业》 2023年第3期12-17,共6页
建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV M基因序列,设计两对特异性引物和TaqMan探针,对PDCoV TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.1... 建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV M基因序列,设计两对特异性引物和TaqMan探针,对PDCoV TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.194,相关系数R 2=0.9992。荧光定量RT-PCR方法仅对PDCoV呈现特异性扩增,无交叉反应。敏感度试验结果显示,最低检出量为1.25×10^(1)copies/μL,灵敏度高。重复性试验结果显示,批内和批间测定均具有良好的重复性。TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法是一种可靠的快速检测PDCoV的方法。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 M基因 荧光定量rt-PCR TAQMAN
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一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因RT-qPCR内参基因筛选 被引量:1
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作者 章杨婷 张燕萍 +4 位作者 黄静妍 王文君 童妍 赵凯 周育真 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2023年第11期2188-2195,共8页
一心维纳斯蝴蝶兰(PhalaenopsisI-HsinVenus)花型优雅、花期持久、花香馥郁,是优良的香花品种,具有较高的园林观赏价值和经济价值。为筛选适用于一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因表达分析的内参基因,本研究以一心维纳斯蝴蝶兰不同... 一心维纳斯蝴蝶兰(PhalaenopsisI-HsinVenus)花型优雅、花期持久、花香馥郁,是优良的香花品种,具有较高的园林观赏价值和经济价值。为筛选适用于一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因表达分析的内参基因,本研究以一心维纳斯蝴蝶兰不同花期(中蕾期、初开期、盛开前期、盛开中期、盛开后期、衰败期)的转录组数据为基础,选取了ACT1、ACT2、ACT3、GAPDH、EF1α、TUA、TUB和Ubi共8个管家基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测候选内参基因在花朵不同发育时期的表达情况,并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper三个内参基因稳定性分析软件对候选内参基因进行分析。综合分析结果表明,ACT1的稳定性最高,可作为一心维纳斯蝴蝶兰相关基因表达分析的最适内参基因。 展开更多
关键词 一心维纳斯蝴蝶兰 内参基因 实时荧光定量PCR 表达稳定性
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基于转录组测序和RT-qPCR技术的烟草糖酯合成基因挖掘 被引量:1
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作者 黄申 闫茗熠 +5 位作者 陈梦月 尚紫博 杨晨 张金林 褚智国 毛多斌 《轻工学报》 CAS 北大核心 2023年第6期78-84,117,共8页
为挖掘调控烟草糖酯合成的功能基因,采用转录组测序对烟草腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因及其功能进行分析,并利用RT-qPCR对分析结果进行验证。结果表明:共获得11962个腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因,其中5145个上调表达基因,6817个... 为挖掘调控烟草糖酯合成的功能基因,采用转录组测序对烟草腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因及其功能进行分析,并利用RT-qPCR对分析结果进行验证。结果表明:共获得11962个腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因,其中5145个上调表达基因,6817个下调表达基因;上调表达基因主要包括生物学进程(2265个)、分子功能(1169个)、细胞成分(363个)3大类,可将基因序列定位到122条代谢通路中,其中与糖酯合成相关的糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷类生物合成被高度富集,腺毛细胞中酰基糖通路显著上调,有12个基因在功能上与酰基转移酶有关;在腺毛细胞中,分析得到的12个基因中有11个基因的表达量都高于叶细胞,其中gene63826、gene16194和gene37511表达分别上调195.79倍、166.23倍和132.65倍。上述11个基因可能参与调控腺毛细胞合成糖酯,为下一步验证基因功能提供依据。 展开更多
关键词 烟草糖酯 腺毛细胞 转录组 差异表达基因 rt-QPCR
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Selection of reference genes for RT-qPCR analysis of Phenacoccus solenopsis(Hemiptera: Pseudococcidae) sex-dimorphic development 被引量:3
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作者 ZHENG Lu-ying ZHANG Zhi-jun +6 位作者 ZHANG Jin-ming LI Xiao-wei HUANG Jun LIN Wen-cai LI Wei-di LI Chuan-ren LU Yao-bin 《Journal of Integrative Agriculture》 SCIE CAS CSCD 2019年第4期854-864,共11页
Mealybugs, such as Phenacoccus solenopsis, are highly sexually dimorphic. Winged adult males present such remarkable morphological differences from females that, to the untrained eye, conspecific adults of both sexes ... Mealybugs, such as Phenacoccus solenopsis, are highly sexually dimorphic. Winged adult males present such remarkable morphological differences from females that, to the untrained eye, conspecific adults of both sexes of P. solenopsis may be considered as two different insect species. A method to investigate sex-dimorphic mechanisms is by evaluating gene expression using RT-qPCR. However, the accuracy and consistency of this technique depend on the reference gene(s) selected. In this study, we analyzed the expression of 10 candidate reference genes in male and female P. solenopsis at different development stages, using common algorithms including the ?Ct method, NormFinder, geNorm, BestKeeper, and a web-based analysis tool, RefFinder. The results showed that EF1-β, RP-L32 and RP-18 S were selected as the most stable genes by both the ?Ct method and NormFinder; TUB-α was the most stable gene identified by BestKeeper; and RP-L40 and RP-L32 were the most stable genes ranked by geNorm. RefFinder, a comprehensive analysis software, ranked the ten genes and determined EF1-β and RP-L32 as the most suitable reference genes for the various developmental stages in male and female P. solenopsis. Furthermore, the two most suitable reference genes were validated by examining expression of the juvenile hormone acid O-methytransferase(JHAMT) gene. Results of the validation portion of the study showed that JHAMT expression was sex-biased towards males and exhibited a dynamic and classic expression pattern among the P. solenopsis developmental stages. The results can help further our knowledge on the molecular mechanisms underlying sexual dimorphic development in P. solenopsis. 展开更多
关键词 Phenacoccus SOLENOPSIS rt-QPCR sexual dimorphic DEVELOPMENT reference gene gene stability
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用RT-qPCR方法评价4个不同猪品种骨骼肌候选内参基因
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作者 陈薪全 潘宇恒 +6 位作者 敬云鸿 牛丽莉 甘麦邻 赵叶 陈蕾 沈林園 朱砺 《四川农业大学学报》 CSCD 北大核心 2023年第6期1107-1115,共9页
【目的】寻找合适的规范化策略研究猪骨骼肌相关基因。【方法】筛选TATA结合蛋白(TBP)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、核糖体蛋白L4(RPL4)、肽基脯氨酸异构酶A(PPIA)、β-2微球蛋白(B2M)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋... 【目的】寻找合适的规范化策略研究猪骨骼肌相关基因。【方法】筛选TATA结合蛋白(TBP)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、核糖体蛋白L4(RPL4)、肽基脯氨酸异构酶A(PPIA)、β-2微球蛋白(B2M)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白(YWHAZ)、β-肌动蛋白(ACTB)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)8个候选内参基因,选取国外引进的长白、约克与杜洛克公猪,进行三元杂交生产的商品猪(DLY),长白、约克猪进行二元杂交的商品猪(LY),成华猪和藏猪共4个品种进行基因表达正常化评价。采用geNorm、NormFinder和BestKeeper3种常用算法评估候选内参基因的稳定性。将3种常用算法的结果进行综合排名。【结果】8个候选内参基因在不同猪种中表现出较高的表达稳定性,但表达循环阈值不同。【结论】运用3种不同的评估算法可以筛选出相似的候选内参基因,该结果可为猪骨骼肌基因表达RT-qPCR分析内参基因的选择提供参考。 展开更多
关键词 rt-QPCR 候选内参基因 基因表达稳定性 骨骼肌
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Reference Genes for RT-qPCR Analysis of Environmentally and Developmentally Regulated Gene Expression in Alfalfa 被引量:2
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作者 Yves Castonguay Josée Michaud Marie-Pier Dubé 《American Journal of Plant Sciences》 2015年第1期132-143,共12页
Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is a highly sensitive technique that has become the standard for the analysis of differences in gene expression in response to experimental treatments or among genetic ... Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is a highly sensitive technique that has become the standard for the analysis of differences in gene expression in response to experimental treatments or among genetic sources. The accuracy of the RT-qPCR results can be significantly affected by uncontrolled sources of variation that can be accounted for normalization with so-called reference genes stably expressed under various conditions. In this study we assessed the stability of 21 reference gene candidates in crowns of two alfalfa cultivars (Apica and Evolution) exposed to various environmental conditions (cold, water stress and photoperiod) and from above ground biomass of the cultivar Orca sampled at three developmental stages (vegetative, full bloom and mature pods). Candidates were selected based on their previous identification in other plant species or their stable expression in a differential hybridization of alfalfa ESTs with cDNA from non-acclimated and cold-acclimated alfalfa. Genes encoding ubiquitin protein ligase 2a (UBL-2a), actin depolymerizing factor (ADF) and retention in endoplasmic reticulum 1 protein (Rer1) were the most stable across experimental conditions. Conversely β-actin (Act), α-tubulin (Tub) and glyce-raldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) frequently used as “housekeeping genes” in gene expression studies showed poor stability. No more than two reference genes were required to normalize the gene expression data under each condition. Normalization of the expression of genes of interest with unstable reference genes led to observations that were conflicting with those made with validated reference genes and that were in some cases inconsistent with the current knowledge of the trait. The reference genes identified in this study are strong candidates for normalization of gene expression in cultivated alfalfa. 展开更多
关键词 ABIOTIC Stress ALFALFA rt-QPCR COLD ACCLIMATION Development Reference geneS
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Use of Real- time RT-PCR Analysis for mRNA Expression of Tobacco Ferritin Gene (NtFer1) 被引量:1
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作者 JIANG Tingbo LI Fengjuan YANG Chuanping 《Journal of Northeast Agricultural University(English Edition)》 CAS 2006年第2期125-128,共4页
To understand the use of real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) for detecting the relative abundance of mRNA, the expression of a tobacco ferrltin gene (NtFer1) was detected b... To understand the use of real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) for detecting the relative abundance of mRNA, the expression of a tobacco ferrltin gene (NtFer1) was detected by Northern blot and real-time RT-PCR. The results indicated that both of the two methods were able to detect mRNA expression of NtFer1 cleady and similady, namely NtFer1 expression was responsive to iron-ovedoad, and the abundance of NtFer1 mRNA was greatly increased after iron loaded for 6 h. To compare the effect and sensitivity of two methods, results revealed that Northern blot need 30 μg of total RNA and at least 3 days for the total protocol performance, whereas real-time RT-PCR only need 2 μg of total RNA and 1.5 h. The real-time RT-PCR is rather sensitive and effective than Northern blot. Real-time RT-PCR analysis can be used to rapidly detect the relative abundance of mRNA expression instead of Northern blot analysis. 展开更多
关键词 FERRITIN gene expression TOBACCO real-time rt-PCR
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Quantification of the expression of chitinolytic enzyme encoding genes ech30, ech42 and nag1 in Trichoderma atroviride P1 under varying growth conditions using a real-time RT-PCR assay
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作者 Jihong Liu Clarke Arne Tronsmo +1 位作者 Nicholas Clarkel Sonja Sletner Klemsdal 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期428-428,共1页
The quantitative expression and the regulation of chitinase-encoding genes ech30, ech42 and nag1 in Trichoderma atroviride P1 under varying growth conditions were investigated using real-time RT-PCR, principle compone... The quantitative expression and the regulation of chitinase-encoding genes ech30, ech42 and nag1 in Trichoderma atroviride P1 under varying growth conditions were investigated using real-time RT-PCR, principle component and multivariate analyses. Twelve media combinations including 0.1% and 3% glucose as carbon source and no (0 mmol/L), low (10 mmol/L) and high (100 mmol/L) ammonium acetate as nitrogen source combined with or without colloidal chitin at 3 time intervals and 2 replications were applied to current study. The real-time RT-PCR analysis showed that the expression of ech30, ech42 and nag1 was regulated by the interaction of nitrogen, glucose and chitin under different growth conditions. The highest and earliest expressions of ech30 were induced by glucose and nitrogen starvation i.e. 0.1% glucose and 10 mmol/L ammonium acetate in the growth media. This was also the case for ech42 and nag1 but at a relatively low level. In contrast, high (3%) glucose and high (100 mmol/L) ammonium acetate concentrations repressed the expression of all the genes studied. These results were confirmed by principle component and multivariate analyses. The effect of chitin on ech30, ech42 and nag1 expression varied depending on the concentrations of glucose and ammonium acetate. 展开更多
关键词 基因 表达 生长条件 rt-PCR 木霉属 真菌
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齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立 被引量:1
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作者 徐匆 黄皓 +3 位作者 黄晓彦 陈彦 李昀哲 郑芝波 《贵州农业科学》 CAS 2023年第4期86-92,共7页
【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因序列分析其序... 【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数为130;大田兰花样品感染齿兰环斑病毒的检出率为100%。【结论】一步法RT-qPCR是一种特异性强、灵敏度高,且适合监测实际生产过程中兰花感染齿兰环斑病毒情况的检测方法。 展开更多
关键词 兰花 齿兰环斑病毒(ORSV) 反转录-荧光定量PCR(rt-qPCR) 外壳蛋白(cp)基因
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Establishment of a Real-time Fluorescent Quantitative RTPCR Method for Detecting NP Gene of Class Ⅰ Newcastle Disease Virus(NDV)
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作者 Junping CAO Xiaoquan WANG +2 位作者 Han CHENG Xiaowen LIU Xiufan LIU 《Agricultural Biotechnology》 CAS 2018年第6期16-19,24,共5页
Newcastle disease( ND) is one of the most serious infectious diseases that infect the poultry industry.There is only one serotype of Newcastle disease virus( NDV),but NDVs can be divided into two distinct classes( cla... Newcastle disease( ND) is one of the most serious infectious diseases that infect the poultry industry.There is only one serotype of Newcastle disease virus( NDV),but NDVs can be divided into two distinct classes( class Ⅰ,and class Ⅱ) according to their genetic relationship.To develop a method for rapid quantitative detection of class Ⅰ NDV,a pair of primers and a TaqM an probe were designed and synthesized according to the conservative sequence of NP gene of class Ⅰ NDV.The positive recombinant plasmid harboring NP gene of JS-18-05 isolate was used as a positive template to establish the standard curve.A real-time fluorescent quantitative RT-PCR method was established for rapid detection of class Ⅰ NDV with strong specificity,high sensitivity and good repeatability.The established method exhibited a good linear relationship within the concentration of 102 to 108 copies of NDV,by which 1 μl of 10 copy of NDV nucleic acid could be detected in the initial template.Compared with conventional virus isolation methods,the established method had similar sensitivity and led to the same results in detecting33 class Ⅰ,class Ⅱ NDV isolates.The study provided the basis for rapid quantitative detection of class Ⅰ NDVs and further clarification of their pathogenicity and pathogenic mechanism in poultry. 展开更多
关键词 CLASS Newcastle disease virus NUCLEOCAPSID protein gene FLUORESCENT quantitative rt-PCR
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2018—2020年福建地区猪瘟病毒E0基因遗传变异分析
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作者 戴爱玲 张鑫杰 +4 位作者 林楚云 尹会方 薛少华 刘建奎 杨小燕 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期201-207,共7页
为了了解2018—2020年福建地区猪瘟病毒流行及遗传变异情况,收集福建省不同地区临床发病猪的血液和肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本1464份,采用RT-nPCR的方法对样品进行CSFV检测,对部分CSFV阳性样品E0基因进行克隆测序。结果显示,CSFV总... 为了了解2018—2020年福建地区猪瘟病毒流行及遗传变异情况,收集福建省不同地区临床发病猪的血液和肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本1464份,采用RT-nPCR的方法对样品进行CSFV检测,对部分CSFV阳性样品E0基因进行克隆测序。结果显示,CSFV总体阳性率为1.9%(29/1464),并获得13株CSFV E0基因序列。同源性分析发现所得13株CSFV E0基因之间的同源性在82.2%-99.7%,其中11株CSFV E0基因与1.1亚型代表毒株HCLV的核苷酸同源性为99.0%~99.9%,与Shimen株的核苷酸同源性94.1%~95.0%;1株与2.1c型参考毒株HNSD-2012核苷酸同源性为98.2%;1株与2.1d亚型毒株CSFV/JPN/2018核苷酸同源性为99.6%。遗传进化分析发现,10株CSFV与HCLV、C-ZJ-2008、Shimen和Brescia处于同一分支,属于1.1亚型;1株CSFV与HNSD-2012等位于同一分支,属于2.1c亚亚型;1株与CSFV/JPN/2018等位于同一分支,属于2.1d亚亚型。氨基酸序列分析发现,13株毒株与HCLV等代表毒株在重要的Rnase活性位点高度保守,其中2株2.1亚型毒株与HCLV毒株相比,其在第35位非关键氨基酸残基上发生由G→E的突变。结果表明福建地区CSFV流行情况趋向多样化,提示仍需加强对CSFV流行及遗传变异的持续监测,为猪瘟的诊断及有效防控奠定基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 rt-nPCR E0基因 遗传变异
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