猪传染性胃肠炎病毒RT-CPA检测方法构建及初步应用

为开发一种猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)RT-CPA快速且准确的检测方法。本试验根据TGEV S基因的D序列,设计了3对引物,使用构建的重组质粒作为标准阳性对照,通过优化筛选条件并应用可视化核酸试纸条,成功建立了一种一步法TGEV RT-CPA检测方法。本实验筛选最优条件为:Mg^(2+)浓度1.0 mmol/L,dNTP浓度0.8 mmol/L,Betaine浓度1.0 mol/L,BstDNA聚合酶浓度8.0 U,反应温度63℃,反应时间60 min,AMV逆转录酶5 U。本研究的扩增产物通过凝胶电泳显示出梯形条带,证明了其对TGEV的特异性检测和重复性良好,灵敏度高达10拷贝/μL。初步应用显示,该方法与TGEV抗原快速检测试剂盒的符合率超过90%,显示了高灵敏度。TGEV RT-CPA方法免去了RNA提取和cDNA合成的步骤,能够完成一步检测,且该方法不需要特殊仪器,适用于现场快速检测TGEV,为快速诊断和防控猪传染性胃肠炎提供了新的技术选择。

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立及临床应用

为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明:优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率介于13.33%~44.44%之间,2018—2022年阳性率介于28.30%~31.58%之间,散养户和规模化猪场的阳性率分别为38.24%和19.13%。说明试验建立的PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法特异、敏感、稳定、准确,洛阳市PEDV变异毒株的流行特点为个别地区较严重的情况、近几年流行率基本持平、散养户流行情况较规模化猪场严重。

猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-RAA检测方法的建立及应用

为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)检测方法,对该方法进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验,并分别采用该方法和实时荧光定量RT-PCR检测方法对72份猪淋巴结、肝脏等组织临床样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的实时荧光RT-RAA方法在41℃条件下反应20 min即可完成检测,对PEDV的最低检测限为1×10~1拷贝/μL;且仅能检测出PEDV,与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRoV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV-4)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)均无交叉反应;相同拷贝浓度的质粒标准品3次重复的扩增曲线几乎重合,起峰时间与荧光值没有明显差异。对72份临床样品进行检测,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。说明建立的实时荧光RT-RAA方法敏感性高,特异性和重复性良好,同时耗时短、操作简单,可用于PEDV的临床检测。

O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测临床常见猪病毒,结果显示可同时检测出FMDV-O和SVV核酸,且与猪水泡性口炎病毒(VSV)、猪水疱病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)、A-1型口蹄疫病毒(FMDVA-1)核酸均无交叉反应,并可检测到FMDV-O PanAsia株、cathay株、Ind-2001株和Mya-98株等主要流行株,特异性强;该方法对含FMDV-O和SVV拼接质粒标准品的最低检测限为7.17×10^(2)拷贝/μL,敏感性高;利用该方法检测了同一时间和不同时间提取的3种不同浓度的质粒标准品,结果显示批内和批间重复性试验Ct值的变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验所建立的方法对30份临床样品进行检测,结果与各病毒单一荧光定量RT-PCR检测结果一致。本研究建立的FMDV-O和SVV双重荧光定量RT-PCR方法能够快速准确的鉴别检测FMDV-O和SVV,为口岸检疫的快速通关提供了技术手段。

赤羽病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并利用该方法与AKAV检疫行业标准推荐方法同时对临床采集的80份牛羊血液样品进行检测,以检验方法的临床应用效果。结果显示:本研究建立的检测方法敏感性较高,最低检测限为13.4 copies/μL;特异性良好,与口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、牛白血病病毒等均无交叉反应;组内试验变异系数为0.93%~2.47%,组间试验为1.25%~2.76%,重复性良好;利用建立的方法从80份临床样品中检出AKAV阳性样品21份,该检测结果与AKAV检疫行业标准推荐方法的符合率为98.75%。结果表明,本研究建立的AKAV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性高,特异性及重复性好,适用于赤羽病临床检测,为赤羽病病原学监测和诊断技术标准开发提供了技术支撑。

RT-F2000在妇科泌尿生殖道病原微生物检测中的诊断与应用

目的探究在妇科泌尿生殖道病原微生物检测诊断中使用RT-F2000(全自动阴道分泌物检测仪)。方法回顾性分析在天柱县人民医院就诊并开展妇科检查的120例受检者临床资料,样本选取时段为2023年1—11月。全部受检者入院后采集生殖道分泌物标本及尿道标本,共120份样本,使用RT-F2000与微生物培养法分别进行泌尿生殖道病原微生物检测。对比两种检测方式的病原微生物检出情况;以微生物培养法为“金标准”,评价RT-F2000检测诊断效能。结果(1)根据120例分泌物标本检测结果可知,使用微生物培养法共检出阳性标本83例,阳性率69.16%;支原体、霉菌、线索细胞、滴虫分别检出34例(40.96%)、25例(30.12%)、14例(16.87%)、10例(12.05%)。使用RT-F2000共检出阳性标本85例,阳性率70.83%;支原体、霉菌、线索细胞、滴虫分别检出35例(41.17%)、25例(29.41%)、15例(17.64%)、10例(11.76%)。两种检查方式检出的阳性率差异不具有统计学意义(P<0.05)。(2)使用微生物培养法检出的83例阳性标本中,单纯病原体感染、混合病原体感染分别为70例、13例,构成比分别为84.34%、15.66%。使用RT-F2000检出的85例阳性标本中,单纯病原体感染、混合病原体感染分别为72例、13例,构成比分别为84.71%、15.29%。(3)与微生物培养法相比,RT-F2000检测支原体符合率为99.17%,检测霉菌符合率为100.00%,检测线索细胞符合率为99.17%,检测滴虫符合率为100.00%。(4)RT-F2000检测支原体Kappa值为0.961,检测霉菌Kappa值为0.938,检测线索细胞Kappa值为0.952,检测滴虫Kappa值为0.974,与微生物培养法有良好的一致性(P>0.05)。结论将RT-F2000应用于妇科泌尿生殖道病原微生物检测,可对患者生殖道病原体实现快速、精准的诊断,体现出了较高的临床推广应用价值。

牛轮状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)便捷检测方法,为福建省BRV的流行病学调查检测提供便捷技术支持。【方法】根据GenBank公布的BRV基因组序列,利用Oligo7.0软件设计并合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测BRV的RT-PCR方法,同时开展了特异性、敏感性和重复性试验,并将建立的方法应用于22份临床样品的检测。【结果】建立的方法仅能够扩增出BRV的特异性片段,对其他畜禽常见病原体无特异性扩增;该方法的灵敏度为6.86×10^(5)copies·μL^(-1)。对22份临床样品进行检测,检测出12份阳性样品,阳性率为54.55%。【结论】本研究建立的BRV RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床样本的检测,为福建省BRV的诊断和流行病学调查提供了技术支持。

多重RT-PCR同时检测6种马铃薯病毒及1种类病毒

病毒病是限制我国马铃薯生产的重要因子之一。本研究通过引物设计和体系优化建立了一套多重RT-PCR检测方法,可以在一个反应体系中同时检测6种马铃薯病毒和1种马铃薯类病毒以及1个马铃薯内参基因,包括马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)、马铃薯M病毒(potato virus M,PVM)、马铃薯S病毒(potato virus S,PVS)、马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)、马铃薯A病毒(potato virus A,PVA)、马铃薯卷叶病毒(potato leaf curl virus,PLRV)、马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunitⅠ,CoxⅠ)基因的特异片段,产物大小依次为181、226、275、565、630、681、359、500 bp,符合理论预期。采用建立的方法以相应病毒和类病毒的质粒作模板进行检测,其检测灵敏度在1.6×10^(-3)~1.8×10^(-1) ng/μL。用该方法检测田间未知样品,结果与DAS-ELISA检测结果高度相符,同时PVY、PVM、PVS、PVX 4种病毒的检出率高于DAS-ELISA,表明该方法准确可靠,可用于以上马铃薯主要病毒和类病毒的快速检测。

基于盖他病毒nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针,以GETV (SC483株) cDNA作为模板,扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中,构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品,采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度,初步建立了一种基于GETV nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板,利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测,结果显示,仅GETV为阳性,SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性,表明该方法特异性较强;分别以10倍倍比稀释(3.07×10^(-1)拷贝/μL~3.07×10^(8)拷贝/μL)的重组质粒标准品p ET29a-nsP3作为模板,利用本研究建立的方法和普通RT-PCR方法分别检测,结果显示,本研究建立的方法对重组质粒标准品的检测限为30.7拷贝/μL,敏感性是普通RT-PCR的100倍,敏感性较高;分别以同一时间及不同时间提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的荧光定量RT-PCR进行组内与组间的重复性试验检测,结果显示,该方法的组内组间变异系数均小于2%,重复性较好。利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法与普通RT-PCR方法分别对来源于GETV感染小鼠的84份组织样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,该TaqMan荧光定量RT-PCR方法对GETV检出率为95.24%(80/84),而普通RT-PCR对GETV的检出率为67.86%(57/84)。二者的阳性符合率达100%。本研究首次基于GETV nsP3基因建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为GETV的检测提供了有效工具。

Mass scale screening of common arboviral infections by an affordable,cost effective RT-PCR method

Objective:To develop a rapid,cost effective RT-PCR method for the mass scale diagnosis of such diseases at the vireraia stage to find out the actual disease burden in that area.Methods:For this purpose,cases with the history of only short febrile illness were considered.Thus 157 samples with the history of dengue/chikungunya like illness and only 58 samples with a history of acute encephalitis syndrome(AES)were selected.Results:Out of 157 samples,42 and 74 were detected as dengue and chikungunya,respectively and out of 58 AES cases only 23 could be detected as Japanese encephalitis by this RT-PCR method.Conclusions:This cost effective RT-PCR method can detect the total positive cases that remain undetected by EL1SA method.Moreover,this method is capable to detect the viral RNA from patients'sera even after the appearance of IgM antibody at one fifth costs as compared with the other commercially available kits.

广东省蒲瓜病毒种类鉴定及多重RT-PCR检测方法的建立

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类,建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法,提高蒲瓜病毒种类鉴定效率,为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间,从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份,对采集的样品按照地区和症状进行分类,提取每份样品的总RNA,将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果,设计特异引物进行RT-PCR验证,从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒,根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物,通过优化反应体系和反应条件,建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中,共检测到12种病毒,按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒(Lagenaria sicerariaalphaendornavirus,LSEV)(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)(62.8%)、小西葫芦虎纹花叶病毒(zucchini tigre mosaic virus,ZTMV)(51.3%)、西瓜绿斑驳花叶病毒(watermelon green mottle mosaic virus,WGMMV)(43.6%)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)(32.1%)、番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)(19.2%)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)(9.0%)、瓜类蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)(7.7%)、中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)(7.7%)、瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)(5.1%)、瓜类黄矮失调病毒(cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV)(3.8%)、甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus,MYSV)(1.3%)。78份样品中,复合侵染率高达80.8%,其中2、3、4、5、6和7种病毒复合侵染的检出率分别为14.1%、16.7%、23.1%、17.9%、7.7%和1.3%。在多重RT-PCR体系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物,12个反应后再加入CGMMV+WGMMV引物,引物体积依次为WVA 0.5μL、CCYV 0.5μL、CGMMV 0.4μL、WGMMV 0.4μL、ZTMV 0.6μL、PRSV 0.6μL,从而确立了一种同时扩增6种病毒的多重RT-PCR检测方法。【结论】危害广东省蒲瓜的主要病毒有12种,其中CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA为优势病毒;复合侵染现象较普遍,以3、4和5种病毒的复合侵染形式占比较高;研发出一种同时检测蒲瓜上6种病毒的多重RT-PCR检测技术,提高了蒲瓜病毒种类鉴定效率。

牛病毒性腹泻病毒通用型及分型RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立快速检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)通用型及1型(BVDV-1)、2型(BVDV-2)的检测方法,并了解聊城地区BVDV的流行规律,试验根据BVDV-1、BVDV-2 5′端非编码区(5′UTR)基因序列分别设计BVDV通用型检测引物及BVDV-1、BVDV-2特异性检测引物,通过优化RT-PCR扩增条件分别建立BVDV通用型RT-PCR、BVDV-1分型RT-PCR、BVDV-2分型RT-PCR检测方法,并分析3种检测方法的特异性、重复性、符合性,最后采用3种检测方法对聊城地区采集的4 685份临床样品进行病原学检测分析。结果表明:3种检测方法检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛轮状病毒均为阴性,检测灵敏度分别为6.84,1.08,3.03 ng;BVDV通用型RT-PCR检测方法与BVDV-1分型RT-PCR、BVDV-2分型RT-PCR检测方法的符合率均为100%;聊城地区BVDV阳性率为6.51%,其中BVDV-1和BVDV-2阳性率分别为4.50%和2.01%,BVDV-1和BVDV-2混合感染率为0.13%。说明试验建立的BVDV通用型RT-PCR、BVDV-1分型RT-PCR、BVDV-2分型RT-PCR检测方法均具有良好的特异性、敏感性、准确性和临床适用性,聊城地区普遍存在BVDV的流行,其流行优势基因型为BVDV-1。

猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法的建立

根据GenBank中登录的猪轮状病毒(PoRV)VP6基因序列特征,设计特异性的引物和探针,条件优化后,建立检测PoRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法.结果表明:建立的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法敏感性高,最低可检测192拷贝·μL^(-1);特异性强,对猪常见病原(如猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒等)检测均为阴性;重复性好,扩增相关系数为0.999,其组内和组间变异系数分别为0.25%~1.26%和0.31%~1.49%.对临床收集的79份猪腹泻病料进行常规RT-PCR检测,检测出阳性样品4份,阳性率为5.06%(4/79);对这79份病料进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测,检测出阳性样品6份,阳性率为7.59%(6/79);同时,4份经RT-PCR检测为阳性的样品经TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测均为阳性,符合率达100%.本研究建立的方法为PoRV早期感染诊断提供检测手段.

PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法的建立与应用

参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的nsp2基因序列,在nsp2大缺失区下游的保守区设计了1条下游引物,在小缺失区设计1条上游引物,用于变异株的扩增。在大缺失区内部设计1条上游引物,与变异株共用下游引物,用于普通株的扩增,建立了PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法。建立的RT-PCR方法用于临床病料的检测,部分阳性结果测序,变异株序列与报道的序列同源性在97%以上。结果表明,该方法特异、快速、简便,可以用于PRRSV变异株和普通株的鉴别。

禽流感病毒通用型RT-LAMP快速检测方法的建立

为建立一种禽流感病毒（AIV）的快速检测方法,本研究根据环介导等温扩增技术（LAMP）原理,设计了针对AIV M基因4个不同区段的特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了AIV的RT-LAMP方法。结果表明,该方法对AIV H1~H16亚型的检测结果均为阳性,而对其他禽类病毒的扩增均为阴性,具有良好的特异性。对AIV的最低检测限为13.43 EID50/m L,灵敏度为普通一步RT-PCR的10倍;扩增反应可以在恒温水浴内60 min内完成;在反应体系中添加荧光染料后,肉眼即可判定检测结果。该检测方法与RT-PCR方法和荧光定量RT-PCR方法对临床样品检测的符合率均为81.8%。该方法能够简便、快速、灵敏、特异地检测AIV。

犬瘟热病毒和犬腺病毒2型双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立犬瘟热病毒(CDV)和犬腺病毒2型(CAdV-2)双重TaqMan荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。本试验针对CDV的N基因和CAdV-2的E3基因设计两对特异性引物与两条标记不同荧光基团的TaqMan-MGB探针,对引物、探针的浓度、反应体系和反应条件进行优化后检测该方法的灵敏度,特异性及重复性。结果:该方法在CDV和CAdV-2阳性参考质粒浓度1×10^(1)~1×10^(7) copies/μL的范围中,R2值为0.997和0.993,表明所建的标准曲线具有良好线性关系,能检测到最低浓度为5 copies/μL,并对其他病原无扩增现象,特异性良好;重复性试验中组内和组间变异系数小于1.54%。综上,建立的双重TaqMan RT-qPCR检测方法具有灵敏度高且特异性好等优点,可用于CDV和CAdV-2临床快速检测和鉴别诊断及流行病学调查等领域。

鸡γ-干扰素实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测鸡γ干扰素的实时荧光定量RT-PCR方法,采用RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ干扰素（ChIFN-γ）和鸡的28 S rRNA（Ch28 S）基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch28 S的RNA,采用各自的特异性引物及Taqman探针,以Ch28 S RNA作为内参进行一步法实时荧光定量RT-PCR,检测ChIFN-γ.结果表明：ChIFN-γ和内参Ch28 S的Ct值与标准品稀释梯度在1×102～1×107拷贝/μL范围分别呈良好的线性关系,γ2均大于0.99.此方法用于检测ChIFN-γ,具有简便、高效、敏感、特异的特点.

猪瘟病毒RT-nPCR检测方法的建立及陕西部分地区猪瘟病毒E0基因分子特征分析

【目的】建立一种基于E0基因高保守性的猪瘟病毒(CSFV)RT-nPCR检测方法,为临床诊断提供一种可靠方法,同时对获得的陕西猪瘟病毒E0基因进行序列分析,揭示猪瘟病毒基因的分子衍化特征,为防控猪瘟提供参考。【方法】根据GenBank中的猪瘟病毒参考序列,设计并合成了2对引物,建立猪瘟RT-nPCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。用该方法对采自陕西部分猪场的32份疑似猪瘟病料进行检测,并对获得的8株流行毒株E0基因进行测序及同源性分析。【结果】建立了猪瘟病毒RT-nPCR检测方法,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为6.7×10-5 ng/L,从BVDV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV等参考毒株中提取或反转录获得的DNA/cDNA中不能扩增出目的条带,提示方法灵敏度高、特异性强。对32份疑似猪瘟组织病料的检测发现,有12份呈现阳性,阳性率为37.5%。序列分析表明,8株流行毒株间E0核苷酸、氨基酸同源性分别在97.0%~99.3%和94.8%~98.5%。与参考毒株的核苷酸同源性为83.4%~95.4%,氨基酸同源性为85.8%~98.1%。流行毒株与我国疫苗毒株HCLV、C HVRI的核苷酸同源性仅为83.4%~85.1%,氨基酸同源性仅为86.1%~89.1%,呈现出较明显的远离疫苗株的变异趋势。进化树分析发现,8个流行毒株均属于基因Ⅱ群。首次发现了1株流行毒株(SXWN02株)E0Rnase活性基序位点第94位由E变异为K,其他位点未发生变异。【结论】建立的RT-nPCR检测方法灵敏度高、特异性强,可作为猪瘟病毒的临床诊断方法。陕西部分地区猪场猪瘟感染仍较严重,需要做好防控工作。流行毒株E0基因发生较大变异,尤其是在关键位点上出现变异毒株,需要密切关注。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎RT-PCR检测方法研究

根据Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ/06强毒株的测序结果,在其基因组3D基因区设计合成一对可扩增238 bp的特异性引物,成功的建立了检测DHV-Ⅰ的RT-PCR方法,并确定了其特异性与敏感性,对DHV-Ⅰ分离毒株和临床病料进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果,而作为阴性对照的常见4种鸭病病原:鸭瘟病毒、鸭产蛋综合症病毒、鸭副粘病毒、鸭里默氏杆菌均未扩增到任何片断。利用BHK-21细胞、SPF鸡胚对DHV-Ⅰ临床病料进行病毒分离鉴定,结果表明建立的DHV-Ⅰ的RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点。