蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立

【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blast比对,用软件MEGA 5.0分析序列差异,根据蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,运用软件Oligo6.0设计引物,对蓝舌病新疆分离株S7基因进行RT-PCR扩增,并验证该方法的特异性及敏感性。【结果】蓝舌病中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与哈尔滨报道BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%;与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%,其余均无同源性序列。中国新疆分离株S7基因片段序列与4条同源序列间存在26处核苷酸差异,9处氨基酸差异。【结论】建立的蓝舌病中国新疆分离株S7基因片段一步法RT-PCR方法具有良好的特异性,仅BTV中国新疆分离株扩增获得目的条带,该方法的敏感性为4.0×10^(3)copies/mL。

建立检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2的mRNA相对表达水平的RT-qPCR方法

目的本研究旨在建立一种实时荧光定量PCR方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平。方法使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)的ABCG2核苷酸序列号NM_001032919.1及内参GAPDH核苷酸序列号NM_001195426.1,借助Primer premier 5.0软件设计PCR引物。提取猕猴新鲜肾组织的总RNA,并反转录合成cDNA。接着,利用PCR引物进行实时荧光定量PCR扩增,并根据反应体系中荧光的变化情况定量分析ABCG2的mRNA相对表达水平。结果PCR产物测序结果显示,扩增的ABCG2和GAPDH核苷酸序列与NCBI上猕猴的序列同源性分别为90.91%和91.14%。ABCG2和GAPDH的扩增效率均达到80%~120%,实时荧光定量PCR标准曲线的熔解曲线为单峰,R2接近1。结论本研究建立的检测猕猴ABCG2 mRNA实时荧光定量检测方法,为研究高尿酸血症的发病机制以及新药开发奠定基础。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

柑橘3种病毒类病原多重RT-PCR检测技术的建立及应用

【目的】建立柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)和啤酒花矮化类病毒(hop stunt viroid,HSVd)的多重RT-PCR检测体系。【方法】设计多重RT-PCR引物,分析其特异性,确定其最佳浓度比、最适退火温度及灵敏度,在此基础上对福建地区的柑橘样品进行检测。【结果】确定了CYVCV-F/R、CTV-F/R和HSVd-F/R等3对引物的最佳浓度比例为1∶1∶2,最适退火温度为52.9℃,灵敏度结果显示该体系可检测模板稀释到10^(-2)的阳性样品。应用该体系对采自福建部分地区的157份柑橘样品进行检测,结果发现,CYVCV、CTV和HSVd的检出率分别为47.1%、56.7%和22.9%。【结论】成功建立了柑橘CYVCV、CTV和HSVd病原的多重RT-PCR检测方法,为该类病害的检测提供准确、快速的检测方法。

葡萄浆果内坏死病毒RT-q PCR检测技术建立及其在葡萄砧木中的时空分布规律

【背景】葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus,GINV)是近年来在中国报道的一种正单链RNA病毒,该病毒发生普遍且危害严重。高灵敏的检测技术是病毒田间监测和无病毒苗木培育的关键。【目的】建立灵敏度较高的GINV逆转录实时荧光定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测体系;明确不同葡萄砧木对GINV的敏感性;明确GINV在寄主植株中的时空分布规律,为该病毒的监测预警提供技术支撑。【方法】根据GenBank已登录GINV的复制酶(replicase,RP)、移动蛋白(movement protein,MP)和外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列设计6套引物,通过常规RT-PCR和RT-qPCR筛选特异性强、扩增效果好的引物。再通过对退火温度和引物浓度等反应条件的优化建立GINV的SYBR Green I染料法RT-qPCR检测体系,并进一步对该技术的灵敏度、特异性和田间适用性进行评价。将GINV接种到贝达、SO4、101-14、140R和1103P 5种葡萄砧木上进行症状观察和病毒检测,以筛选GINV敏感性较高的指示植物。基于所建立的RT-qPCR技术对接种GINV葡萄砧木的不同生长时期、不同部位样品进行GINV检测,从而明确GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。【结果】建立了GINV SYBR Green I染料法RT-qPCR检测技术体系,其最佳引物为GINVRPYGF2/R2,最佳引物浓度为300 nmol·L^(-1),最佳退火温度为58.4℃。该技术对GINV的检测特异性强,其检测灵敏度达常规RT-PCR的1 000倍。症状观察结果表明贝达感染GINV的症状最为严重,表现为叶片系统性坏死,而其他砧木叶片仅表现褪绿斑驳和环斑症状。RT-qPCR检测结果表明GINV在EL27时期(坐果期)的相对含量最高,5个品种间的病毒相对含量在EL12(花序分明期)和EL27时期间无显著差异,EL31时期(果实增大期)的贝达与SO4、101-14、140R和1103P的病毒相对含量存在显著差异;GINV的相对含量在不同组织部位存在较大差异,由高到低依次为下部叶片、上部叶片、上部茎秆、下部茎秆、根部。【结论】建立了灵敏度高、特异性强的GINV RT-qPCR检测方法,利用该方法明确了GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。

一步RT-PCR法检测苹果锈果类病毒和苹果凹果类病毒

由类病毒引起的苹果病害在中国苹果主产区普遍发生,严重制约苹果产业的健康发展。对采自不同地区的带有典型症状的弘前富士、南方脆及惠民短枝富士果实,进行苹果锈果类病毒(ASSVd)和凹果类病毒(ADFVd)检测,发现两种病毒能够共侵染。根据ASSVd和ADFVd保守序列设计通用引物,建立了能快速、同时检测两种类病毒的RT-PCR方法。

基于PCR技术的松材线虫分子检测技术研究进展

松材线虫是世界性检疫对象,并对我国林业造成了严重的危害。由于线虫个体较小且鉴定特征单一,利用传统的形态学鉴定较为困难,因此客观的分子生物学鉴定方法显得尤为重要。本研究总结了近些年主要的松材线虫PCR检测技术及其与拟松材线虫的区别,阐述了常规PCR技术、PCR-PFLPs检测技术、RAPD和SCAR分子标记技术以及荧光PCR技术等各类检测技术的特异性序列、片段大小和应用场景,并探讨了各检测技术的优缺点,为后期研究提供参考。

猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法的建立和应用

目的:建立一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法。方法:选择云南省大理地区患有猪支原体肺炎疾病的60只猪作为研究对象,针对猪肺炎支原体的保守序列p36基因设计了引物和探针,建立猪支原体肺炎RT-PCR检测反应体系,并对其灵敏度、特异性、重复性进行分析及临床样本验证。结果:RT-PCR检测灵敏度为10^(2)拷贝、与PRRSV、PPV、FMDV、PCV、CSFV、APP等无交叉反应,批内和批间变异系数均小于2.00%,肺组织样本检出阳性数26例(86.67%),鼻拭子样本检出阳性数19例(63.33%)。结论:该研究成功建立了一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法,具有较高的检测灵敏度和特异性,重复性能良好,这为后期MPS的临床精准诊断和疫病科学防控提供试验依据。

病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测方法的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测技术体系,同时,与实时荧光定量RT-PCR方法进行对比分析。试验结果显示,病毒性出血性败血症病毒数字PCR最佳退火温度为58.5℃。灵敏性试验显示,随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释,稀释至105倍数时,数字PCR体系仍可以检测到阳性微滴,因此,确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字PCR的检测低限。特异性试验表明,该方法只与目标病毒——病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增,与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验结果表明,病毒性出血性败血症病毒数字PCR批内与批间试验的变异系数均小于1%,具备良好的重复性。利用构建的数字PCR方法,对收集到的国内及进境鱼类样品共计1210批次进行病毒性出血性败血症病毒检测,结果显示,数字PCR阳性样本检出率为9.5%,常规实时荧光定量RT-PCR阳性样本检出率为7.69%~7.77%。临床试验结果表明,研究建立的病毒性出血性败血症病毒数字PCR方法较常规技术具有更高的检测灵敏性,适用于水生动物疫病精准检测的需求。

马病毒性动脉炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×10^(7)拷贝/μL~1.6×10^(2)拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R^(2)=0.9927,初步建立了EAV荧光定量RT-PCR方法。采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×10^(2)拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好。采用本实验建立的荧光定量RT-PCR方法和文献发表的EAV荧光定量RT-PCR方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%。本研究建立的荧光定量RT-PCR检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路。

牛病毒性腹泻病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和临床应用

为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示:所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。

O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测临床常见猪病毒,结果显示可同时检测出FMDV-O和SVV核酸,且与猪水泡性口炎病毒(VSV)、猪水疱病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)、A-1型口蹄疫病毒(FMDVA-1)核酸均无交叉反应,并可检测到FMDV-O PanAsia株、cathay株、Ind-2001株和Mya-98株等主要流行株,特异性强;该方法对含FMDV-O和SVV拼接质粒标准品的最低检测限为7.17×10^(2)拷贝/μL,敏感性高;利用该方法检测了同一时间和不同时间提取的3种不同浓度的质粒标准品,结果显示批内和批间重复性试验Ct值的变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验所建立的方法对30份临床样品进行检测,结果与各病毒单一荧光定量RT-PCR检测结果一致。本研究建立的FMDV-O和SVV双重荧光定量RT-PCR方法能够快速准确的鉴别检测FMDV-O和SVV,为口岸检疫的快速通关提供了技术手段。

蜜蜂慢性麻痹病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)快速诊断方法,本研究根据CBPV RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.998;该方法最低检出限为10拷贝/μL,与蜜蜂急性麻痹病毒等常见蜜蜂病毒无交叉反应,具有良好的灵敏性和特异性;组内和组间变异系数分别低于0.5%和2%,具有较好的稳定性。本研究建立的CBPV荧光定量RT-PCR检测方法,可用于实验室检测、流行病学调查和疫情监测。

传染性法氏囊病毒新型变异株荧光定量RT-PCR检测方法的建立

传染性法氏囊病病毒新型变异株(Novel variant Infectious bursal disease virus,nVarIBDV)给我国养禽业防控法氏囊带来更大的挑战。目前缺乏快速、灵敏的针对nVarIBDV的检测方法。为解决这一问题,该试验根据已发表的nVarIBD的VP2基因序列,设计了一对引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种nVarIBD的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,该方法可通过特异性扩增nVarIBD VP2基因来确定样品是否为IBDV新型变异株。通过构建重组质粒pMD18-T-VP2对引物和探针进行灵敏性和重复性试验,以及特异性检测,最后使用该检测方法对临床样品进行验证。荧光定量RT-PCR结果显示灵敏性可达1.32×10^(1)copies/μL,高于常规RT-PCR的100倍。批内和批间重复试验变异系数(CV)均小于0.5%,结果表明该检测方法有良好的重复性与稳定性。该方法与常见禽病毒核酸无交叉反应,说明检测方法具有较好的特异性。综合本研究结果表明,该研究建立的nVarIBD荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于临床样品中IBDV新型变异株的监测。

大蒜病毒多重RT-PCR检测体系的建立与应用

【目的】建立一套多重RT-PCR方法,用于同时检测和鉴别大蒜大田植株和组培苗5种病毒/病毒组。【方法】根据相关文献和GenBank公布的参考病毒株序列,设计了5对分别针对青葱潜隐病毒(Shallot latent virus,ShLV)、大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latent virus,GarCLV)、韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)和青葱X病毒属病毒(allexiviruses)的特异性引物,扩增产物大小分别为592、431、338、265、190 bp。利用建立的多重RT-PCR方法,分别对24份大蒜组培苗和48份大田样本进行病毒检测分析。【结果】通过单重/多重PCR及序列比对验证了检测系统的特异性。通过退火温度和引物比例优化,确定退火温度为56.6℃且ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV、allexiviruses引物体积比为10∶8∶3∶3∶16时,扩增效果最好。5种病毒/病毒组的最低检测浓度均为1.0×10^(2) copies/μL。大蒜组培苗病毒检测结果具有丰富的多样性,大田样品被至少2种病毒/病毒组感染,病毒/病毒组之间可以清晰区分。【结论】开发的多重RT-PCR方法可以快速、有效地检测和鉴别大蒜ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV和allexiviruses这5种病毒/病毒组的感染情况。

牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒四重一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立与应用

为了建立一种能够同时、快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)的方法,根据BVDV 5'UTR基因、BEV 5'UTR基因、BRV VP6基因、BCV N基因设计引物,建立了能够同时鉴别检测BVDV、BEV、BRV、BCV的四重一步法RT-PCR方法,该方法检测IBRV、BPIV-3、BRSV均为阴性,对BVDV、BEV、BRV、BCV的核酸检测下线分别为3.28、28.2、23.6、25.0 pg,与现有标准或商品化RT-PCR试剂盒的符合率均为100%,批内和批间重复性试验的检测结果均完全一致,检测222份临床样品的BVDV、BEV、BRV、BCV阳性率分别为15.32%、18.02%、6.31%和4.05%。说明四重一步法RT-PCR方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,可用于BVDV、BEV、BRV、BCV的临床鉴别诊断、流行病学调查以及疫病防控。

牛源新型环状病毒RT-qPCR方法的建立和应用

目前世界范围内仅分别从日本西南的与那国岛(2015年)及中国云南省景洪市勐罕镇(2019年)的哨兵动物牛上分离到过新型环状病毒Yonaguni orbivirus(YONOV),但尚缺乏该病毒核酸的特异性检测方法。该研究对比我国分离的YONOV毒株JH2019C603和日本毒株(ON-7/E/15)的基因序列,选择编码非结构蛋白3(Non-structural protein 3,NS3)的Segment-10(Seg-10)节段的保守区设计引物和探针,并分别进行了特异性、灵敏度、重复性和临床血液样品的测试,建立了牛YONOV的RT-qPCR和RT-PCR检测方法。结果显示,两种方法能特异性扩增YONOV核酸片段,对其他环状病毒无有效扩增;RT-qPCR和RT-PCR检出YONOV核酸浓度的下限分别为11.5 copies/μL和115.0 copies/μL;两种方法均能检测出毒株或动物临床血样中的YONOV核酸,并且能在动物感染并产生中和抗体前1周检测出病毒核酸,因此更适用于病毒感染动物的早期诊断。RT-qPCR因其更高的灵敏度和实效性,能用于大量临床样品的快速检测,而RT-PCR的扩增产物可以进行测序,获取待测毒株的基因信息,两种检测方法相互辅助,可以为YONOV的核酸检测及动物感染该病毒的诊断及流行病学研究提供技术支撑。

猪δ冠状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV M基因序列,设计两对特异性引物和TaqMan探针,对PDCoV TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.194,相关系数R 2=0.9992。荧光定量RT-PCR方法仅对PDCoV呈现特异性扩增,无交叉反应。敏感度试验结果显示,最低检出量为1.25×10^(1)copies/μL,灵敏度高。重复性试验结果显示,批内和批间测定均具有良好的重复性。TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法是一种可靠的快速检测PDCoV的方法。